ÖLI-bilaga 16
Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Övre luftvägsinfektioner (ÖLI)
Metod
1. Cellodling
Cellinsådd: 50 000 celler/mL medium.
Odlingsbetingelser: 37°C, CO2 ej nödvändigt annat än vid uppodling av frusna celler. Odlingsflaskorna förvaras stående, eftersom cellerna växer fritt i mediet.
Skötsel: Cellerna delas 1/2 en gång/vecka. Häll bort så mycket medium som möjligt, varefter flaskan skakas, och hälften av det kötsel:kvarvarande mediet med celler hälls av (dessa celler kan odlas vidare för att fördubbla cellmängden eller användas för preparatframställning). Tre dagar senare görs mediumbyte. Ca 3/4 av mediet hälls försiktigt av och ersätts med nytt.
Nedfrysning av celler
I kryorör sätts ca 2xl0e7 celler/ml RPMI med 20 % inaktiverat fetalt kalvserum och 10 % DMS0. Nedfryses långsamt enligt laboratoriets metod för frysning av celler (speciell cellfrys är att föredra, annars exempelvis frigolitbox i -70°C över natt eller från -20°C till halsen på kväveklockan över natt). Cellerna slutförvaras i flytande kväve.
Upptagning av nedfrusna celler: Kryorören tinas i rumstempererat vatten. Innehållet överförs till 25 cm2 plastflaskor med 15 ml medium. Odlas i CO2.
Efter 24 timmar sugs det gamla mediet försiktigt av, och ersätts med nytt. När mediet gulnat (brukar ta ca 4 dagar) sker delning och skötsel enligt tidigare angivna metoder.
Preparatframställning
P3FIR1 (för detektion av antikroppar mot lytiska antigener): Cellkulturen används 1 vecka efter delning. Medium med uppslammade celler centrifugeras (400g, 10 min), därefter ytterligare 2 ggr efter uppslamning i PBS. Cellerna räknas och slammas upp i PBS i en koncentration av 10e6/ml. Cellerna droppas på rena objektglas (helst maskade) 20-30 μl/prep. Får lufttorka, och fixeras därefter i vattenfri, iskall aceton (5 min). Preparaten förvaras vid 4°C och kan användas under 1 vecka.
NC37 (för framställning av EBNA-preparat): Cellkultur används 2 dagar efter delning. Häll bort 4/5 av mediet, centrifugera medium och celler 10 min, 400g. Häll bort supernatanten, slamma i 5 ml PBS. 5 ml cellsuspension sätts till ett rör med 2 ml Ficoll. Centrifugeras (400g, 20 min). Cellbandet sugs av och sköljs x 2 genom uppslamning i PBS och centrifugering. Cellema räknas i vitalfärgning. Minst 80 % ska vara levande för preparatframställning Slamma cellerna i PBS, 5 milj/mL. Centrifugera och sug bottensatsen torr. Tillsätt 200 μl hypotonlösning. Slamma upp cellerna och droppa på objektglas. 5-10 μl/prep. Lufttorka, fixera i vattenfri aceton/metanol 2/1. Förvaras vid 70°C.