MRSA-screening enligt Halmstadmodellen

Artikel uppdaterad april2012

---

Till förgreningssidan MRSA

---

MRSA-screening enligt ”Halmstadmodellen”

Introduktion

Metoden gör det möjligt att utesluta förekomst av MRSA i 80-90 % av negativa prover inom ett dygn. Övriga prover odlas ytterligare ett eller två dygn innan de kan slutsvaras. För att åstadkomma detta odlas provet i en selektiv buljong (4 mg/L cefoxitin) över natt. Antalet S. aureus celler i buljongen bestäms sedan med en kvantitativ realtids-PCR baserad på nuc-genen(1). De prover som innehåller S. aureus-antal under en definierad cutoff svaras ut som negativa. Övriga odlas ut på fasta substrat för MRSA-identifiering. Principen bygger på att MRSA anrikas till nivåer över cutoff, känsliga stammar gör detta i mycket mindre utsträckning. Specificiteten i PCR-steget är 80-90 %. Prover svaras därför ut positiva för MRSA endast efter odlingsfynd.

Anrikning och provpreparation

Provpinnen eller 50 µL urin inokuleras i 3-5 mL FOX-buljong.

Inkubera också tunt inokulat av MRSA-kontrollstam CCUG35600 i ett rör som positiv preparationskontroll. Inkubera 37 °C i skakinkubator (110 rpm) minst 16 timmar. Efter inkubering vortexas odlingen och 100 µL förs över till sterilt 1,5 mL eppendorfrör. Om prover skall ”poolas” tag 100 µL av varje (högst 3 prover per pool) till ett rör. Centrifugera röret 14 000 rpm 3 minuter och avlägsna genast överfasen. Resuspendera pellet i halva ursprungsvolymen StafLys (20 mM Tris-HCl pH 7,6 (Sigma), 0,5 % Tween20 (Sigma), 0,5 % Igepal CA-630 (Sigma) och 60 µg/mL ProteinasK (Roche Diagnostics)). Inkubera sedan röret 56 °C 60 minuter följt av 5 minuter 95-99 °C. Centrifugera provet 10 000 rpm 1 minut inför PCR-analys.

Mängdstandard

Mängdstandard bereds i korthet från en övernattsodlad BHI-kultur av MRSA CCUG 35600. Med ”viable counts” bestäms CFU/mL för suspensionen varefter celler lyseras på samma sätt som proverna. Lysatet späds sedan i StaffLys utan proteinasK till lämpliga koncentrationer utifrån ”viable count”-resultat (t.ex.$10^{8}$, $10^{6}$, $10^{5}$, $10^{4}$ CFU/mL).

Alternativt kan en mängdstandard beredas från isolerat och koncentrationsbestämt kromosomalt DNA från en S. aureus kontrollstam.

• Recept: FOX-buljong
  • Innehåll Gram/L
  • proteos peptone (Oxoid L85) 15,0
  • liver digest (Oxoid L27) 2,5
  • yeast extract (Oxoid L21 5,0
  • NaCl (Merck) 25,0
  • mannitol (Scharlov), 10,0
  • phenyl red (Merck) 16 mg/L
  • Cefoxitin (Sigma) 4,0 mg
  • Aztreonam (Bristol-Meyers Squibb) 8 mg
• pH 7,0 ± 0,1 vid 25 °C

Kvantitativ nuc-PCR

Genom att analysera fyrapunkters mängdstandard parallellt med proverna kan antalet S. aureus-celler/mL i buljongerna bestämmas. Buljonger som innehåller färre än $10^{4}$ CFU/mL svaras ut som negativa, 10 µL av övriga buljonger odlas ut på substrat lämpliga för identifiering av S. aureus.

Reaktionsvolymen är 25 µL, använd 5 µL templat. Mastermixen skall innehålla 1 x Quanta Perfecta qPCR Fast mix (WWR), 0,9 uM vardera av primrar NUC4 och NUC5 samt 0, 25 uM av TacqMan-prob NUC-RQ.

• Primer-och probsekvenser (4)
  • NUC4 5´- TCA AGT CTA AGT AGC TCA GCA AAT GC –3´
  • NUC5 5´- GAA GTT GCA CTA TAT ACT GTT GGA TCT TC –3´
  • NUC-RQ 5´-FAM-TCA CAA ACA GAT AAC GGC GTA AAT AGA AGT GGT TCT - TAMRA -3

• Temperaturprofil i RotorGene Q/6000
  • Enzymaktivering- 95 °C 3 minuter.
  • Amplifiering och detektion- 95 °C 3 sekunder. 65 °C 20 sekunder.
  • Fluorescensmätning Green channel 40 cykler.

REFERENSER

• 1.Brakstad et al. 1992. Detection of Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction amplification of the nuc gene. J Clin Microbiol. 30: 1654-1660.

• 2.39th Annual Meeting of the Infectious Society of America. 2001. San Fransisco paper n.o. 183: MRSA detection in patients in less than 24 h with a Light Cycler (Roche) real-time PCR-based method. Nilsson, P, & Ripa, T.

• 3. Nilsson, P., H. Alexandersson, and T. Ripa. 2005. Use of broth enrichment and real-time PCR to exclude the presence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in clinical samples: a sensitive screening approach. Clin Microbiol Infect. 11:1027-34.
• 4. Ej publicerad egen design av TaqMan-PCR. Peter Nilsson, Klinisk mikrobiologi, Hallands sjukhus Halmstad.