Neisseria gonorrhoeae, substrat för odlingsdiagnostik, Bilaga 1

Från Referensmetodik för laboratoriediagnostik
Hoppa till navigering Hoppa till sök

Huvudartikel: Gonorré

Sekundärlänk: Gonorré-laboratoriediagnostik

Seltgcagar.jpg
Gcpreseerv.jpg
Gcsockerplattor.jpg
Gcbiokemi.jpg


Transportmedium för odlingsdiagnostik av N. gonorrhoeae

  • 1. Okolad provtagningspinne (exempelvis rayonarmerad aluminiumpinne (CP116C) för uretra och konjunktiva; och rayonarmerad plastpinne (CP114C) för cervix, rektum, vagina och farynx). Alternativt kan motsvarande kolade provtagningspinnar användas.
  • 2. Amies kolade transportmedium (Copan, Brescia, Italien). Alternativt: Amies okolade transportmedium (Copan, Brescia, Italien) om kolade provtagningspinnen (se ovan) användes.


Fasta odlingssubstrat för isolering av N. gonorrhoeae

A. Icke-selektivt odlingsmedium för N. gonorrhoeae

Användningsområde

Näringsrikt medium för isolering av näringskrävande bakterier, speciellt patogena Neisseria (gonokocker och meningokocker) och Haemophilus species, från kliniska prov. Antibiotikaresistensundersökning av gonokocker om hästserum ej inkluderas i mediumet.

Princip

GC-agar baserat medium som ytterligare näringsberikas med hemoglobin (från nötblod), hästserum och Isovitalex Enrichment. GC-agarbas utnyttjar som många andra blod-agarbaser kaseinhydrolysat och köttextrakt (peptoner) som kväve-, vitamin-, aminosyra- och kolhydratkälla. Kornstärkelse neutraliserar toxiska fettsyror och toxiska metaboliter. Reducerad agarmängd och fosfatbuffring bidrar till bättre och snabbare växt av framförallt gonokocker. Natriumklorid bibehåller osmotiska balansen. Hemoglobin tillför mediet bland annat X-faktor (hemin) som krävs för tillväxt av vissa mer krävande GC-stammar. Hästserumtillsats neutraliserar ev. variation av GC-agarbasen. IsoVitaleX tillför V-faktor (nicotinamide adenine dinucleotide, NAD), en förutsättning för växt av H. influenzae, men som tillsammans med extra vitaminer, aminosyror, coenzym, glukos, järnjoner, mm. också ökar tillväxten av patogena Neisseria.


Icke-selektivt odlingsmedium för N. gonorrhoeae (deklaration per liter) Difco GC Medium Base (Becton, Dickinson and Company (BD))* 36,0 g Reverse osmosis (RO)-vatten 900 mL BBL Hemoglobin Powder; Bovine, Freeze-dried (BD) 10,0 g Hästserum (inaktiverat; Statens veterinärmedicinska anstalt (SVA)) 100 mL BBL IsoVitaleX Enrichment (BD)** 10 mL

Proteose Peptone No. 3 15,0 g Corn Starch 1,0 g Dipotassium phosphate 4,0 g Monopotassium phosphate 1,0 g Sodium chloride 5,0 g Agar 10,0 g

Vitamin B12 0,1 mg L-Glutamine 100 mg Adenine 10 mg Guanine hydrochloride 0,3 mg p-aminobenzoic acid 0,13 mg Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) 2,5 mg Thiamine pyrophosphate 1,0 mg Ferric nitrate 0,2 mg Thiamine hydrochloride 0,03 mg L-Cysteine hydrochloride 259 mg L-Cysteine 11 mg Dextrose (Glucose) 1000 mg

pH 7,20,2 vid 25 C Dispensering: 20 mL per 9 cm petriskål. Hållbarhet: 2 veckor, 4 veckor i plastad vagn och 8 veckor i sluten plastpåse vid +2-8 ºC.


Rekommenderad kontrollstam Tillväxtskontroll: N. gonorrhoeae CCUG 10130 (långsamt växande).


2.B. Selektivt odlingsmedium för N. gonorrhoeae (Modifierat Thayer-Martin medium, MTM)

Användningsområde Näringsberikat medium för selektiv isolering av patogena Neisseria (gonokocker och meningokocker) från kliniska prov.

Princip Selektiva odlingsmediumet för patogena Neisseria (modifierat Thayer-Martin medium (MTM)) motsvarar icke-selektiva mediumet (se ovan) med tillsats av VCNT Inhibitor. Denna innehåller vankomycin (hämmar grampositiva bakterier), kolistin (hämmar andra gramnegativa bakterier inkluderande apatogena Neisseria tillhörande normalfloran), nystatin (hämmar svamp) samt trimetoprim (hämmar gramnegativa bakterier inkl. Proteus).

Selektivt odlingsmedium för N. gonorrhoeae (deklaration per liter) Difco GC Medium Base (BD)* 36,0 g Reverse osmosis (RO)-vatten 900 mL BBL Hemoglobin Powder; Bovine, Freeze-dried (BD) 10,0 g Hästserum (inaktiverat; SVA) 100 mL BBL IsoVitaleX Enrichment (BD)* 10 mL BBL V-C-N-T Inhibitor (BD)** 10,0 mL

Se icke-selektivt odlingsmedium ovan för deklaration

Vankomycin 3,0 mg Kolistin 7,5 mg Nystatin 12 500 enheter Trimetoprimlaktat 5,0 mg

pH 7,20,2 vid 25 C Dispensering: 20 mL per 9 cm petriskål. Hållbarhet: 4 veckor i sluten plastpåse vid +2-8 ºC.

Kommentar: N. lactamica (kolistinresistent), och vissa stammar av N. subflava, N. cinerea, M. catarrhalis, K. denitrificans samt vankomycinresistenta Staphylococcus epidermidis, kan även växa. Enstaka gonokockstammar kan hämmas av inkluderade koncentrationer av vankomycin eller trimetoprim. Detta problem är försumbart i flesta geografiska områden, inklusive Sverige, och framförallt om både selektivt och icke-selektivt odlingssubstrat användes för flera av provtyperna.


Rekommenderade kontrollstammar Tillväxtskontroll: N. gonorrhoeae CCUG 10130 (långsamt växande) alternativt N. gonorrhoeae CCUG 33979. Inhibitionskontroll: S. aureus ATCC 29213 (eventuellt även E. coli, N. sicca och C. albicans).


3. Fast substrat för tillväxtberoende biokemisk (kolhydrat¬nedbrytning) specieskonfirmering av patogena Neisseria

Användningsområde Medium för specieskonfirmering inom Neisseria genus. N. gonorrhoeae bryter ej ner maltos eller fruktos utan endast glukos, vilket resulterar i bildandet av sura nedbrytningsprodukter, sänkt pH, och således färgomslag i plattan innehållande glukos. Fenolrött ingår i mediumet som pH-indikator. Likvärdig tillväxt-oberoende snabbmetod för specieskonfirmering finns.

Basagar (deklaration per liter) Starch (Merck) 1,0 g Sodium alginate (BDH) 1,6 g K2HPO4 (Merck) 4,0 g NaCl (Riedel de Haen) 5,0 g Agar No 2 (Lab M) 14,0 g Bacto Peptone (BD) 15,0 g Lösning av: Fenolrött (BDH) 0,5 % och NaOH 1 M (Bie & Berntsen A-S) 2 % 10,0 mL Lösning av: Hemin crystalline (bovine) (USB) 0,05 % och NaOH 1 M (Bie & Berntsen A-S) 1 % 4,0 mL L-Histidine hydrochloride (SIGMA)-lösning 0,02 % 10,0 mL Triethanolamine (Merck)-lösning 10 % 0,8 mL RO-vatten 1000 mL

pH 7,80,1 vid 25 C (pH=8,1 innan sterilisering)




GC kolhydratnedbrytningsplattor (deklaration per liter) Basagar enligt ovan 1000 mL Jästextrakt* 100,0 mL Lösning av: L-Glutamine (Merck) 2,5 % och -NAD (SIGMA) 0,1 % 2,0 mL L-Cysteine hydrochloride H2O (BDH)-lösning 1,58 % 3,5 mL Humanserum (inaktiverat) 100,0 mL Kolhydratlösning (Dextrose, Fruktose eller Maltose; J.T. Baker) 20 % 60,0 mL

Bacto Yeast Extract (BD) 10 g Thiamine hydrochloride (SIGMA) 2,0 mg Choline chloride (SIGMA) 1,4 mg Sodium D-pantothenate (SIGMA) 2,0 mg Myo-Inositol (Merck) 0,36 mg Thiamine pyrophosphate chloride (ICN) 0,46 mg L-cystine (SIGMA) 36 mg HCl 1 M (Bie & Berntsen A-S) 3,0 mL

Enligt ovan framställes en omgång av plattor innehållande glukos, maltos respektive fruktos.

pH=7,80,1 vid 25 ºC Dispensering: 20 mL per 9 cm petriskål. Hållbarhet: 3 månader i sluten plastpåse vid +2-8 ºC.


Rekommenderade kontrollstammar Funktionskontroll vid ny batch samt vid varje analystillfälle: N. gonorrhoeae CCUG 33979, N. lactamica CCUG 5853 (alternativt N. meningitidis CCUG 3269), N. sicca CCUG 34456 och M. catarrhalis CCUG 34455.


4. Immunologiska eller antigena metoder för species¬konfirmering av N. gonorrhoeae

Användningsområde Den kommersiella metoden Phadebact Monoclonal GC Test (Bactus AB) för påvisning av antigen baseras på coagglutination med specifika monoklonala antikroppar riktade mot PorB hos gonokocker. Metoden har mycket hög sensitivitet och specificitet om strikt följsamhet till tillverkarens anvisningar praktiseras.

Rekommenderade kontrollstammar Funktionskontroll vid ny batch och därefter en gång per månad: N. gonorrhoeae CCUG 33978 (serogrupp WI [PorB1a]) och N. gonorrhoeae CCUG 33979 (serogrupp WII/III [PorB1b])


5. Preserveringsmedium för N. gonorrhoeae Användningsområde Spädnings- och preserveringsmedium vid frysförvaring av bakterier, inklusive Neisseria species.

Preserveringsmedium för N. gonorrhoeae (deklaration per liter): BBL Trypticase Soy Broth (BD) 30,0 g Bacto Yeast Extract (BD) 3,0 g Agar No 2 (Lab M) 0,5 g RO-vatten 700 mL Hästserum (inaktiverat; SVA) 300 mL

pH=7,50,1 Dispensering: 1 mL i sterila frysrör med skruvkork. Hållbarhet: 4 veckor vid +2-8 ºC.

Rekommenderad kontrollstam Funktionskontroll vid ny batch: N. gonorrhoeae CCUG 33979. Adekvat överlevnad (maximal minskning av ”colony forming units” (CFU) med en 10 potens) efter preservering vid -70 ºC över natt. För längre tids förvaring bör bakteriestammarna frysas i rekommenderat frysmedium eller likvärdigt vid -70-80 ºC, i flytande kväve eller frystorkas.

Hämtad från "http://referensmetodik.folkhalsomyndigheten.se/index.php?title=Neisseria_gonorrhoeae,_substrat_för_odlingsdiagnostik,_Bilaga_1&oldid=339"