Tuberkulos och mykobakterios-laboratoriediagnostik

Artikeln uppdaterad januari 2010

---

Huvudartikel: Tuberkulos (tidigare Referensmetodik:Mykobakteriologisk diagnostik)

och

Atypiska mykobakterier

---

Laboratoriediagnostik av tuberkulos och mykobakterios

Allmänt

Referensmetoden för påvisande av mykobakterier inkl M. tuberculosis-komplexet är odling. Det är viktigt att erhålla isolat för resistensbestämning och epidemiologisk typning. Odling av mykobakterier tillhörande M. tuberculosis-komplexet kräver säkerhetslaboratorium med skyddsnivå 3 enligt gällande föreskrifter från Arbetsmiljöverket. På grund av mykobakteriernas långsamma tillväxt rekommenderas mikroskopi och nukleinsyrapåvisning som viktiga komplement för snabbare diagnostik.

Referensmetodik

Odling

Odlingsförfarandet är utformat så att växt av både MTB och icke tuberkulösa mykobakterier (NTM) gynnas.

Referenssubstrat: Löwenstein-Jensen (LJ) äggbaserat fast medium med glycerol eller natriumpyruvat (se Bilaga 6 Mykobakterier; substrat-och reagensrecept). Alternativt kan Middlebrook agar användas men det används traditionellt inte i Sverige för rutindiagnostik. För flytande odling finns kommersiella Middlebrook-buljonger. För optimal känslighet rekommenderas odling på minst ett fast och ett flytande medium.

Homogenisering, dekontamination och koncentrering: Prov som normalt är kontaminerade med normalflorans snabbväxande bakterier (t.ex. sputum) dekontamineras och digereras med NALC(N-acetyl-L-cystein)-NaOH metoden enligt nedan. Andra vanligt förekommande dekontamineringsmetoder som t. ex Natriumlaurylsulfatmetoden anses ge sämre känslighet.

Enligt Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI):

• NALC och NaOH, Reagens
  • A. 4% NaOH ----- 500 mL
  • B. 2.9 % natriumcitrat dihydrat eller 2.6 % vattenfri natriumcitrat ----- 500 mL
  • C. NALC (tillverka dagligen) ----- 5 g
  • D. pH 6,8 fosfatbuffert (eller sterilt destillerat vatten)

Blanda A och B, sterilisera och förvara för användning senare. Tillsätt reagens C strax innan användning. Förbrukas inom 24 timmar.

• 1. För över 5-10 mL prov till ett 50 mL centrifugrör.
• 2. Tillsätt motsvarande volym av NALC-NaOH-lösningen
• 3. Skaka röret 5-20 sekunder med Vortex
• 4. Låt stå i 15 min
• 5. Tillsätt steril pH 6,8 fosfatbuffert (eller sterilt destillerat vatten) till 50 mL-markeringen, skruva åt korken och blanda innehållet genom att vända på röret
• 6. Centrifugera vid 3000 x g i 15 min.
• 7. Häll eller sug omedelbart av supernatanten.
• 8. Resuspendera pelleten i 1-2 mL saltlösning eller fosfatbuffert.
• 9. Blanda försiktigt och inokulera på odlingsmedia och preparatglas. Om inokulering på odlingsmedia försenas resuspendera i 0,2 % BSA fraktion V istället för vatten eller saltlösning.

Om man endast har tillgång till centrifug för 10 mL rör kan en mindre mängd tillsatt prov (1-2 mL) accepteras.

Kontaminerade prov i större mängd (t.ex. urin, ventrikelsköljvätska): Proven bör centrifugeras, helst i 50 mL rör. I vissa fall kan t.ex. 5 x 10 mL rör användas.

Från bottensatsen överförs 1-2 mL till centrifugrör, varefter behandling utförs enligt ovan.

Kroppsvätskor från normalt sterila lokaler; cerebrospinalvätska, benmärg och blod, dekontamineras inte.

Sputum från CF/PCD-patienter, faeces, tarmbiopsier och obduktionsmaterial: tillsätt PANTA, 2 droppar/LJ-rör, före inokulering av provmaterialet.

Vid stora mängder bör centrifugering ske före odling och ev. behandling.

Vävnad, biopsier:

• 1. Provet homogeniseras i steril mortel.
• 2. 1 mL PBS tillsätts.
• 3. Skakas i Vortex.

Blod, benmärg: För ändamålet avsedda buljongflaskor för odling av mykobakterier inokuleras med provmaterial.

Isolering

Provmaterialet kan inokuleras och fördelas dels på fast substrat och dels på flytande. Av provmaterialet inokuleras 0,3-0,5 mL på minst ett LJ-rör. Till röret sätts vid behov (t ex feces eller prover från CF patienter) en lämplig antibiotikakombination för att undertrycka kontaminerande flora, t.ex. PANTA (Polymyxin, Azlocillin, Nalidixin, Trimetoprim, Amfotericin B) (Becton Dickinson). Inkubation sker under 8 veckor i 37 °C.

Prov från ytliga lokaler (sår, hud) samt prover från t ex CF patienter inokuleras på ytterligare minst ett rör enligt ovan för inkubation i 30 oC. (för växt av t ex M. marinum och M. abscessus).

Prov inkuberas i Middlebrook-buljong för automatisk odling i t ex MGIT-systemet (Becton Dickinson). Prov från ytliga lokaler, leder, skelett och luftvägsprov från CF-patienter kan även inokuleras i ett buljongrör som inkuberas i 30 °C och avläses manuellt.

Cerebrospinalvätska förbehandlas inte utan odlas direkt på LJ-rör samt Middlebrook-buljong.

Blod/benmärg inokuleras helst direkt vid provtagning i blododlingsbuljong avsedd för mykobakterier, upp till 5 mL av provet.

Supplement som tillhandahålls av tillverkaren tillsätts på laboratoriet. Lymfocyter i blodet kan ge ett visst utslag som om växt skulle förekomma i buljongen.

Avläsning

LJ-rör inspekteras minst varje vecka under 8 veckor. Mikroskopipreparat görs från misstänkta kolonier för att konfirmera förekomst av mykobakterier med Ziehl-Neelsen färgning eller Auraminfärgning.

Kolonimorfologin varierar mellan arterna och inom arten beroende på tillväxtbetingelserna från ‘smooth’ till ‘rough’. Kolonierna kan vara opigmenterade (från svagt gulvita) till beige, gula och mera sällan skära till orange. Pigment kan bildas i mörker (skotokromogena) eller endast vid belysning (fotokromogena). Tillväxten är långsam med generationstider 2-20 tim. Synliga kolonier kan observeras efter ca 2-7 dagar (snabbväxare) eller 10 dagar - 8 veckor (långsamväxare). Optimal temperatur för tillväxt varierar från 30 °C (M. marinum) till 45 °C (M. xenopi). De flesta arterna växer på Middlebrook-buljonger eller Löwenstein-Jensen agar, vissa kräver tillsats av t ex järn (t. ex. M. haemophilum, M. genavense) eller mykobaktin (M. avium subart paratuberculosis).

Buljongodlingssystem som MGIT bygger på (automatisk) detektion av mykobakterieväxt. Inkubation under 6 veckor är standard vid primärisolering. Vid växt konfirmeras mykobakterier med mikroskopi enligt ovan, samt odlas ut på LJ substrat.

Identifiering och minimikriterier

Mycobacterium tuberculosis-komplexet

Växt av (oftast) cordbildande syrafasta bakterier på LJ-substrat eller Middlebrook-buljong. Positiv DNA-hybridisering på odlingsisolatet eller tidigare positiv nukleinsyrapåvisning i provet. M. tuberculosis är normalt in vitro resistent mot tiophen-2-carboxylsyrahydrazid (TCH) 5 mg/L och känslig för pyrazinamid, även om avvikelser (TCH =S) eller (PZ = R) förekommer. Även biokemiska tester som nitratreduktion eller niacinproduktion (M. tuberculosis är positiv i båda) förekommer.

M. bovis är alltid TCH-känslig och PZ-resistent.

Konfirmering av M. bovis och M. bovis-BCG bör ske med molekylära metoder t ex spoligotypning (Smittskyddsinstitutet), eller med ett diagnostiskt kit, som med PCR/omvänd hybridisering kan påvisa M tuberculosis, M. bovis, M. bovis-BCG, M. africanum I m.fl. (Genotype, Hain Lifescience).

Icke-tuberkulösa mykobakterier, NTM.

Växt av (oftast) icke-cordbildande syrafasta bakterier på LJ eller Middlebrook-substrat. Artbestämning sker främst med diagnostiska kit (PCR/omvänd hybridisering eller 16S sekvensering).

Alternativa diagnostiska metoder

Mikroskopi

Mikroskopisk undersökning av sputum är en snabb, enkel och specifik diagnostisk metod som kan diagnosticera flertalet fall av smittsam lungtuberkulos. Det krävs dock ca 10.000 mykobakterier per mL sputum för positivt resultat, varför mikroskopi inte är tillräckligt känsligt för diagnostik av mykobakterie-förekomst, utan bör alltid kompletteras med odling och eventuellt nukleinsyrapåvisning. Auraminfärgning för fluorescensmikroskopi eller Ziehl-Neelsen färgning för ljusmikrokopi är de vanligaste förekommande metoderna. Färgen kan inte avlägsnas med syra-alkohol, vilket gett upphov till beteckningen ‘syrafasta bakterier’. Syrafastheten kan delvis gå förlorad i vissa faser av tillväxt, och är inte sällan partiell på snabbväxande icke-tuberkulösa mykobakterier.

Vid fluorescensmikroskopi ser man ett större synfält varför avläsningen går snabbare och känsligheten är också något högre. Metoden rekommenderas därför i första hand för undersökning av direktpreparat. Vid ljusmikroskopi efter Ziehl-Neelsen färgning anses man bättre kunna se bakteriernas morfologi, varför metoden har rekommenderats för konfirmering av positiva direktpreparat samt för undersökning av preparat från odlingsisolat. Betydelsen av detta förfarande har sannolikt minskat i takt med introduktionen av molekylära metoder för artidentifiering varför endast fluoroscensmikroskopi torde vara tillräckligt i de flesta fall.

Smittsamhetsbedömning görs med mikroskopi av sputum, och är naturligen av störst intresse före behandling, men kan också ge indikation på återfall om bakterieantalet ökar kraftigt under behandling. Sensitiviteten jämfört med odling är ca 25 % om inte anrikat sputum används och ca 50 % om sputum förbehandlas och centrifugeras. Specificiteten är vanligen > 99 %.

Man kan inte med mikroskopi differentiera mellan M. tuberculosis-komplexet och NTM. Nukleinsyrapåvisning bör utföras för MTB vid fynd av syrafasta bakterier i luftvägssekret för att klarlägga om det rör sig om TB eller NTM.

OBS att risken för kontamination av provet med ovidkommande mykobakterier bör beaktas. Källor för kontamination kan vara t.ex. kranvatten, (M. gordonae m.fl.), färgvätskor och immersionsolja.

• Homogenisering av prov: Prov bör homogeniseras och koncentreras med centrifugering >3000 x g för att öka sensitiviteten av mikroskopi och odling. Viskösa prov görs flytande genom förbehandling (se ovan under primärisolering).

• CLSI: Utstryk och fixering: Utstryk prepareras på vanligt sätt och fixeras genom upphettning med gaslåga tre gånger eller i 65 - 75 °C i minst 2 timmar på en elektrisk preparatvärmare. Fluorescensfärgning med auramin: Fixerade preparat exponeras för auraminlösning 15 min. Skölj med vatten. Avfärga med syra-alkohollösning 2 min. Skölj med vatten. Kontrastfärga med kaliumpermanganat i 2 minuter. Skölj och lufttorka. Färgning i kyvett rekommenderas inte eftersom det finns en dokumenterad risk för korskontaminering mellan prover. Om det av praktiska skäl inte kan undvikas bör kyvetterna rengöras noga och preparat från primärprover och odlingsisolat får inte färgas i samma kyvett. Kontaminationsrisken bör beaktas vid avläsning.

Reagens, se Bilaga 6 Mykobakterier; substrat-och reagensrecept.

Auramin står på Arbetsmiljöverkets lista över carcinogena ämne varför speciella åtgärder krävs för att hantera och omhänderta ämnet. V g se [1]

Avläsning

Screening av preparat kan ske vid lägst 250 × förstoring (objektiv 20× eller 40×, okular 10-12,5×). Blåljus från 100W Hg-lampa med filterkombination för auramin eller LED illuminator kan användas. Granska minst 30 synfält. Använd större förstoring för att identifiera misstänkta mykobakterier (”beading” i MTB, se t.ex. ASM-manual). Rekommendation att positiva preparat bedöms av ytterligare en avläsare alternativt att färgning med Ziehl-Neelsen görs.

Kvalitetskontroll

En standardiserad preparatkontroll inkluderas vid varje färgningstillfälle. M. gordonae eller annan apatogen mykobakterieart rekommenderas som positiv kontroll och t ex E. coli som negativ.

Molekylärbiologiskt påvisande

Direktpåvisning av M. tuberculosis-komplexet med polymeraskedjereaktionen, PCR, eller liknande molekylärbiologiska metoder, är viktiga snabbdiagnostiska metoder, speciellt vid lungtuberkulos. Sålunda visades redan 1993 med PCR sensitivitet 83 % och specificitet 99 % gentemot odling för luftvägsprov. Samma metoder kan användas för serösa sekret och även vävnadsprov. Särskilt i de senare är bakteriemängden ofta låg och inhibitorer kan störa reaktionen, varför sensitiviteten är lägre.

Eftersom icke viabla bakterier kan påvisas med PCR kan odlingsnegativa prov vara sant PCR-positiva. Stabiliteten hos DNA möjliggör detektion av DNA från M. tuberculosis komplex i formaliniserade prov och även i t.ex. luftvägsprov efter insatt tuberkulosbehandling.

Sensitiviteten för mikroskopipositiva prov är ca 95-100 % jämfört med odling. För mikroskopinegativa prov är sensitiviteten ca 50- 60 % jämfört med odling. Specificiteten är 99-100 %. Negativ PCR utesluter således inte tbc! Inhibitorer i sekret och vävnader kan minska sensitiviteten i PCR. Sköljning av materialet med PBS kan avlägsna inhiberande substanser (detta behövs ej för NALC-NaOH förbehandling). Även i likvor finns inhibitorer varför spädning och centrifugering bör ske men hellre bör andra DNA-preparationsmetoder rekommenderas.

PCR-tekniken är krävande trots att utmärkta kits finns på marknaden. Strikta rutiner behövs för att hindra kontamination av laboratoriet med amplifierat material. PCR bör endast utföras i laboratorier som har resurser för samtidig mykobakterieodling, så att kontinuerlig jämförelse av resultaten kan ske. Slutlig bakteriologisk diagnostik med differentiering inom M. tuberculosis-komplexet kan för närvarande inte ske utan odling. Resistensbestämning sker heller vanligen inte utan odling.

Resistensbestämning av MTB-komplexet

Stammar av MTB som inte utsatts för tb-läkemedel är känsliga för dessa. Dock föreligger en spontan mutationsfrekvens på $10^{-}$$^{7}$- $10^{-}$$^{8}$, för olika läkemedel. Resistensutveckling i bakteriologisk mening uppkommer genom selektionstryck vid inadekvat terapi, varvid den resistenta mutanten snabbt kommer att dominera. Samlad klinisk erfarenhet av tbc-behandling har visat att denna blir effektiv om frekvensen resistenta mutanter i bakteriepopulationen understiger 1 % för vart och ett av de ingående medlen. För praktiskt bruk tillämpas därför gränsen 1 % vid in vitro resistensbestämning för tuberkulostatika. Följande medel är förstahandsval: isoniazid, etambutol, rifampicin (även rifabutin) och pyrazinamid. Resistensbestämning mot andra- och tredjehandspreparat liksom MIC-utförs, när så önskas, vid referenslaboratoriet vid Smittskyddsinstitutet.

För att snabbt erhålla ett preliminärt resultat för rifampicin- och isoniazidresistens gällande M. tuberculosis-komplexet kan molekylärbiologisk påvisning utföras med kommersiellt kit (t ex HAIN). Känsligheten att detektera INH-resistens är ca 90 % och för rifampicin 95-98 %. Resultaten ska dock konfirmeras vid positiv odling i samband med sedvanlig resistensbestämning.

MGIT

Resistensbestämning av M. tuberculosis-isolat mot isoniazid (INH), rifampicin samt etambutol kan utföras i flytande medium, MGIT-rör, med fluorescensindikator. BACTEC MGIT 960 SIRE Kit är ett kvalitativt test som tar 4-13 dygn. BACTEC MGIT 960 PZA kit för resistensbestämning mot pyrazinamid (PZA) tar 4-21 dygn. Testen bygger på jämförelse av M. tuberculosis-isolatets tillväxt med och utan antibiotika. Kolonier utvuxna på fast substrat eller växt i MGIT-rör kan användas som inokulat. Instrumentet indikerar att resistensbestämningen är klar att tolkas när signifikant växt är uppmätt i växtkontrollen (inom tillåten tidsrymd, t ex 4-13 dygn).

Tabell. Följande testkoncentrationer används i MGIT-rören

Preparat	 		Koncentration 
Förstahandspreparat	
Isoniazid			0,1 mg/L		
Isoniazid $^{1}$$^{)}$	                0,4 mg/L		
Rifampicin			1 mg/L
Rifabutin			1 mg/L				
Etambutol			5 mg/L			
Pyrazinamid			100 mg/L

Andrahandspreparat	
Amikacin			1 mg/L
Moxifloxacin		        0,25 mg/L		
Ofloxacin			2 mg/L				

Tredjehandspreparat
Kapreomycin			2,5 mg/L		
Etionamid			5 mg/L			
Kanamycin			4 mg/L			
Linezolid			1 mg/L 		
Streptomycin			1 mg/L
Cyklosporin$^{2}$$^{)}$
PAS$^{2}$$^{)}$

$^{1}$$^{)}$För isoniazid utförs vid behov MIC – bestämning (0,5 – 16 mg/L)
$^{2}$$^{)}$Cykloserin och PAS testas inte i MGIT systemet utan på LJ-medium med den s k proportionsmetoden. 
Brytpunktskoncentrationen är 40 resp 1 mg/L för dessa preparat. 

Stammar resistenta mot INH och rifampicin (Multidrug-resistant TB, MDR-TB) skickas till referenslaboratorium, Smittskyddsinstitutet, för verifiering av resistens samt utvidgad resistensbestämning mot de ovan listade preparaten. Isolat som också är resistenta mot någon fluorokinolon och ytterligare något av de injicerbara andrahands-eller tredjehandspreparaten benämns extensively drug-resistant TB (XDR-TB).

Resistensbestämning av NTM

Resistensbestämning av NTM utförs i regel inte eftersom den kliniska relevansen av ett NTM fynd ofta är oklar och att det för flertalet arter och antibiotika inte finns någon dokumenterad korrelation mellan in vitro MIC och klinisk effekt. I följande fall kan dock resistensbestämning övervägas:

• Vid infektion med M. avium-komplexet som står på behandling med klaritromycin (alternativt azitromycin) som sviktar på behandling alternativt vid profylaxgenombrott hos HIV patient. I dessa fall bör MIC bestämning mot klaritromycin utföras.
• Vid planerad behandling av infektion med vanliga snabbväxande mykobakterier som t ex M. abscessus, M. chelonae eller M. fortuitum-komplexet.
• För långsamväxande NTM finns inte någon enskild metod för resistensbestämning som rekommenderas generellt. För MAC rekommenderar CLSI en buljongbaserad metod som t ex BACTEC 460 (systemet är dock på väg att utfasas under 2010) eller mikrotiterspädning. För övriga långsamväxande NTM kan både fast och flytande medium användas men måste valideras och kvalitetssäkras för varje metod och species.

För snabbväxande NTM rekommenderar CLSI MIC-bestämning med mikrotiterspädning. Agartest inklusive E-test rekommenderas ej.

Beträffande rekommenderade medel för resistensbestämning för respektive art hänvisas till Griffith DE, Aksamit T, Brown-Elliott B, et al. An official ATS/IDSA Statement: Diagnosis, Treatment, and Prevention of Nontuberculous Mycobacterial Diseases, American Thoracis Society Documents. Am J Respir Crit Care Med. 2007;Vol 175: 367-416.

För icke-tuberkulösa mykobakterier är det önskvärt om möjligt att alla arter som resistensbestäms åtföljs av en ATCC-stam av samma art. Då det rör sig om få isolat är det lämpligt att ev resistensbestämning utförs på laboratorier med erfarenhet av resistensbestämning av NTM.

Epidemiologisk typning

Molekylärepidemiologisk typning av M. tuberculosis-komplexet sker för att kartlägga smittkedjor och uppkomna kluster av tuberkulosfall. För detta sänds väl utvuxna förstagångsisolat från varje patient på fast substrat till Smittskyddsinstitutet.

Isolat erhållna vid behandlingssvikt, recidiv eller befarad reinfektion bör också undersökas. Förutom patientens ID, provtagningsdatum, och provets ID, bör även provmaterial, resultat av mikroskopi och resistensbestämning meddelas, enklast genom att skicka med en kopia av laboratoriets slutsvar.

För närvarande utgör RFLP (restriktions-fragment-längd-polymorfism) referensmetodik för molekylärepidemiologisk typning, men alternativa PCR-baserade typningsmetoder (främst spoligotypning och MIRU-VNTR) utvärderas som komplement till eller ersättning av RFLP.

Resultaten av RFLP för ett isolat redovisas som graden av identitet (ID) med den befintliga RFLP-databasen eller med ett givet prov:

• 100 % ID: stammarna tillhör ett kluster, epidemiologiskt samband är sannolikt.
• >90 % ID: epidemiologiskt samband kan inte uteslutas.
• <90 % ID: unikt mönster, inget epidemiologiskt samband.

Vid förekomst av < 5 band i RFLP kompletteras undersökningen med spoligotypning. Vid identiskt spoligotypningsmönster anses stammarna tillhör ett kluster.

Information om RFLP-resultat meddelas till:

• Insändande laboratorium,
• SMI epidemiologiska enheten, som meddelar
• vederbörande smittskyddsläkare,
• som kontaktar vederbörande kliniker i fall av klusterbildning.

Om flera smittskyddsläkare involveras samordnar Statsepidemiologen utredningen.

Kvalitetskontroll

• Referensstammar enl CLSI för kvalitetskontroll av odlingsmedium:
  • M. tuberculosis ATCC 25177
  • M. kansasii ATCC 12478
  • M. fortuitum ATCC 6841

BCG, stam Copenhagen, BCG-vaccin, Statens Serum Institut, se FASS.

Svarsrutiner

Direktmikroskopi

Provet rapporteras som positivt i mikroskopi om syrafasta bakterier påträffas i preparatet. Antalet bakterier kan vara ett grovt mått på effekten av behandling, men utsöndringen är intermittent. Därför är detaljerad kvantifiering vansklig och förutsätter höggradig standardisering.

Förslag till svarsalternativ som dock kan justeras beroende på metod som används:

• 1-9 stavar/preparat : Ange antalet stavar (gäller andra prov än luftvägsprover, bedöm med försiktighet t ex 2 syrafasta stavar, osäkert fynd nytt prov kan rekommenderas, alternativt telefonkontakt)
• 10-20 stavar/preparat: Sparsam förekomst av syrafasta stavar
• 1-9 stavar/synfält: Måttlig förekomst av syrafasta stavar
• >10 stavar/synfält: Riklig förekomst av syrafasta stavar

Vid negativt utfall:

• <10 stavar/preparat (minst 30 synfält): Inga syrafasta stavar (gäller luftvägsprov) (metodens känslighet bör anges som kommentar).

Kommentaren: Odling pågår. Beräknad svarstid för denna bör läggas till samtliga direktmikroskopiresultat.

Nukleinsyrapåvisning

• Positiva prov svaras:M. tuberculosis-komplexet DNA PÅVISAT.
• Negativa prov svaras: M. tuberculosis-komplexet DNA EJ påvisat. (metodens känslighet bör anges som kommentar).
• Prov som innehåller inhibitorer svaras: Resultatet av DNA-analysen kan inte tolkas p.g.a inhiberande substanser i provmaterialet

Kommentaren: Odling pågår. Beräknad svarstid för denna bör läggas till.

Preliminär resistensbestämning

Om preliminär resistensbestämning utförts med molekylärbiologisk metod:

• Preliminärt resultat av resistensbestämning med molekylärbiologisk metod: INH = känslig (alt. resistent), rifampicin=känslig (alt resistent) (metodens känslighet bör anges som kommentar).
• Om analysen är utförd direkt från provmaterial kan läggas till: Resistensresultat konfirmeras när odling blir positiv.
• Om analysen är utförd från isolat kan läggas till: Konfirmerande resistensbestämning med referensmetod pågår.

Odling

Svarsalternativ vid positivt mikroskoperingsresultat från koloni/buljong:

• Om cordbildande isolat med positivt verifierande resultat i PCR eller omvänd hybridisering:
  • Växt av: M. tuberculosis-komplexet , art- och resistensbestämning pågår.

• Om ej cordbildande eller ej bedömbart om cordbildande:
  • Växt av: Mykobakterier, artbestämning pågår (Alternativt avvakta artbestämning innan svar.)

Svara stegvis allteftersom artbestämning och resistensbestämning är klara.

• Negativ odling svaras:
  • Ingen växt av mykobakterier.

Uppmana remitterande läkare att rapportera nya fall till smittskyddsläkare. Klinisk rapportering sker endast för M. tuberculosis-komplexet.

Laboratorierapportering

Alla M. tuberculosis-komplex isolat och alla isolat med icke-tuberkulösa mykobakterier rapporteras via SMI-net av respektive laboratorium.

Infektion med M. tuberculosis regleras av smittskyddslagen (2004:168) - Allmänfarliga sjukdomar och infektion med Mycobacterium species av smittskyddslagen - anmälningspliktiga sjukdomar utöver allmänfarliga sjukdomar. Endast för tuberkulos föreligger smittspårningsplikt.

REFERENSER

• Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI), Laboratory Detection and Identification of Mycobacteria; Approved Guideline, CLSI document M48-A ([ISBN 1-56238-669-7]) Wayne PA: CLSI; 2008

• Griffith DE, Aksamit T, Brown-Elliott B, et al. An official ATS/IDSA Statement: Diagnosis, Treatment, and Prevention of Nontuberculous Mycobacterial Diseases, American Thoracis Society Documents. Am J Respir Crit Care Med. 2007;Vol 175: 367-416

• Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI). Molecular Diagnostic Methods for Infectious Disease; Approved Guideline – Second Edition. CLSI document MM3-A2. Wayne PA:CLSI; 2006.

• Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI)/NCCLS, Susceptibility Testing of Mycobacteria, Nocardia, and Other Aerobic Actinomycetes; Approved Standard. CLSI/NCCLS document M24-A. Wayne PA: NCCLS;2003

• Huard R C, de Oliviera Lazzarina L C, Butler W R, van Soolingen D, Ho L H. 2003. PCR-based method to differentiate the subspecies of the Mycobacterium tuberculosis complex on the basis of genomic deletions. J Clin Microbiol. 41:1637.

• Brosch R, Gordon SV, Marmiesse M, Brodin P, Buchrieser C, Eiglmeier K, Garnier T, Gutierrez C, Hewinson G, Kremer K, Parsons LM, Pym AS, Samper S, van Soolingen D, Cole ST. 2002. A new evolutionary scenario for the Mycobacterium tuberculosis complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 99: 3684-9.

• Cavanagh R, Begon M, Bennett M, Ergon T, Graham IM, De Haas PE, Hart CA, Koedam M, Kremer K, Lambin X, Roholl P, Soolingen Dv D. 2002. Mycobacterium microti infection (vole tuberculosis) in wild rodent populations. J Clin Microbiol. 40:3281-5.

• DeBoer A S, Blommerde B, de Haas P E W, Sebek MMGG, et al. 2002. False-positive Mycobacterium tuberculosis cultures in 44 laboratories in the Netherlands (1993-2000): Incidence, risk faktors, and consequences. J Clin Microbiol. 40: 4004-9.

• Canetti G, Froman S, Grosset J et al. 1963. Mycobacteria:laboratory methods for testing drug sensitivity and resistance. Bull WHO. 29: 565-78.

• Inderlied C. Antimycobacterial agents: In vitro susceptibility testing, spectrums of activity, mechanisms of action and resistance, and assay for activity in biological fluids. In: Antibiotics and Laboratory Medicine, V Lorian Ed. Williams & Wilkins 1996.

• Woods G L, Bergmann J S, Witebsky F G et al. 1999. Multisite reproducibility of results obtained by the broth microdilution method for susceptibility testing of Mycobacterium abscessus, Mycobacterium chelonae, and Mycobacterium fortuitum. J Clin Microbiol. 37:1676-82.

• Inderlied CB, Pfyffer GE. Susceptibility test methods: Mycobacteria. ASM Manual, ASM, Washington, 2003, p 1149-1177.

• Van Soolingen D et al. 1993. Comparison of various repetitive DNA elements as genetic markers for strain differentiation and epidemiology of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 31:1987-95.

• Bauer J et al. 1999. Usefulness of spoligotyping to discriminate IS 6110 low-copy-number Mycobacterium tuberculosis complex strains cultured in Denmark. J Clin Microbiol. 37:2602-6.