Spa-typning av Staphylococcus aureus och MRSA
Sida under bearbetning april 2012. Innehåll ej godkänt
Spa-typning av Staphylococcus aureus och MRSA
Bakgrund
Vid Spa-typning analyseras genom sekvensering den polymorfa variabla regionen X i protein A genen (spa). Genen finns hos alla bakterier av arten S. aureus och kodar för protein A på cellytan. X-regionen består av ett variabelt antal 24 basparsrepetitioner flankerat av väl konserverade regioner. Spa-typning drar nytta av tekniska fördelar som snabbhet och reproducerbarhet och den är också på ett enkelt sätt kommunicerbar. Typning är enkel men kräver apparatur för DNA-sekvensering.
Det finns en internationellt erkänd nomenklatur där resultatet av spa-typning uttrycks enligt ett system som utarbetats viduniversitetet i Münster i Tyskland och som nu används av alla länder i Europa. För ändamålet finns en väl underhållen internetbaserad global databas (StaphType, RidomSpaServer.ridom.de) som underlättar det epidemiologiska arbetet och möjliggör också jämförelser mellan länderna.
Numera utförs i första hand så kallad spa-typning för kartläggning av smitta med S. aureus och MRSA. I vissa sammanhang, framför allt i samband med internationella jämförelser, kan även multi locus secquence typing (MLST), användas. För att säkrare kunna kartlägga ett utbrott, framförallt med de vanligaste Spa-typerna, kan komplettering med PFGE vara användbar. I Sverige är spa-typerna t002, t008 och t044 vanligast med över 100 isolat vardera under år 2008. De tio vanligaste typerna står för cirka 50 procent av de svenska fallen.
Utförande
För utförandet behövs PCR-instrument, sekvenseringsinstrument och programvaran Ridom StaphType (Ridom GmbH)
Förbrukningsmaterial Pipettspetsar Transferpipett 1,5 ml centrifugrör Filtertips 20 μl Filtertips 100 μl Filtertips 200 μl Filtertips 1000μl Distilled Water DNase/RNase free (Gibco) PCR tubes 0,2 ml ”Sample tubes” 0,5 ml Septa till ”Sample tubes” POP 6, acrylamid-gel 61 cm sekvenserings-kapillär
Reagenser
Lysostaphin 100 μg/ml i 50 mM Tris proteinase K 5 mg/ml Primer SPA 1113f sekvens; 5’ TAA AGA CGA TCC TTC GGT GAG C 3’ Primer SPA 1514r sekvens; 5’ CAG CAG TAG TGC CGT TTG CTT 3’ Taq (DNA) polymerase Reaktionsbuffert 10 x dNTP/dUTP mix 30 mM MgCl2 BigDye Terminator ready reaction cycle sequencing kit (Life technologiesTM) 3M NaAc 95% etanol 70% etanol
Analysprocedur
DNA-extraktion av S. aureus från stam på agarplatta
1. Slamma 4-10 kolonier med engångsplatinös i 100 μl 100 μg/ml lysostaphin i 1,5 ml eppendorfrör. Inkubera minst 30 min vid 37° C. 2. Tillsätt 4 μl proteinase K 5 mg/ml, inkubera minst 30 min. vid 56° C. 3. Inkubera provet 15 min. 95° C. Späd provet 1/100 i vatten. Provet är nu klart för PCR-analys.
PCR-amplifiering
Mastermix för 24 prov 24 µl, 10 pmol/µl SPA 1113f 24 µl, 10 pmol/µl SPA 1514r 120 µl, reaktionsbuffert x 10 Taq enzym dilution 6 µl, 5U/µl Taq DNA polymeras 96 µl, 10mM dNTP/dUTP mix (Fermentas) 72 µl, 30 mM MgCl2 615 µl destillerat sterilt DNase och RNase fritt vatten
Till varje PCR-kapillärrör sätts 10 µl templat dvs DNA-extrakt från S. aureus 10 pg/µl.
PCR-programmets utformning vid amplifiering: Inledningsvis 10 min 80°C, därefter 35 cycler omfattande 45 sek 94°C, 45 sek 60°C och 90 sek 72°C, programmet avslutas med en cycel 10 min 72°C.
Rening av PCR-produkt från ej inkorporerade primrar och dNTP.
Använd QIAquick PCR purification Kit enligt tillverkarens rekommendationer.
Sekvensering av PCR-produkten
Inmärkning sker i 0,2 ml microrör
4 µl Primer SPA 1113f 4 µl BigDye Terminator ready reaction cycle sequencing kit 1.1 (Life technologiesTM) 2 µl reaktionsbuffert 3 µl mål-DNA (PCR-produkt från ovanstående reaktion) 7 µl vatten
PCR-programmets utformning vid inmärkning för sekvensering:
25 cycler; 15 sek 96°C, 10 sek 50°C och 4 min 60°C därefter 5 sek 60°C och 60 sek 15°C
Rening av inmärkt PCR-produkt inför sekvensering
1. 2 μl 3M NaAc samt 50 μl 95%-ig etanol sätts till den inmärkta produkten.
Blanda försiktigt, för över till 0,2 ml centrifugrör och låt stå och fälla 20 min i
rumstemp. Sätt på 90°C värmeblock.
2. Centrifugera 16.000 x g minst 20 min och avlägsna supernatanten.
Sätt till 250 μl 70%-ig etanol för att tvätta pelleten och blanda försiktigt.
3. Centrifugera 16.000 x g minst 5 min och sug försiktigt bort supernatanten
med en filtertipp. Torka försiktigt ur röret med en bomullspinne.
4. Sätt rören med öppna lock i 90°C värmeblock 2,5 min för att avdunsta spriten.
Låt stå och svalna på bänken 10 min.
5. Tillsätt 15 μl formamid till rören, blanda försiktigt och centrifugera ned snabbt.
Värm proven 90°C 2,5 min. Ställ dem genast i ett frysblock 2 min. och för
sedan över provet till ett 0,5 ml sekvenseringsrör. Sätt på septan och placera röret
i ett för sekvensering speciellt provrörsställ.
Provet är nu redo för sekvensering!
Analys av sekvenseringsresultatet
Sekvensen analyseras med programvaran Ridom StaphType (Ridom GmbH) och den aktuella stammen erhåller på så sätt ett SPA - nummer