Clostridium difficile

Från Referensmetodik för laboratoriediagnostik
Hoppa till navigering Hoppa till sök

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Tarminfektioner, 2:a upplagan 2002

Clostridium difficile

Smittämnet

Clostridium difficile är anaeroba sporbildande grampositiva stavar. De utgör en vanlig orsak till diarré i anslutning till behandling med antibiotika och andra medel som påverkar den normala tarmfloran. Organismen är i Sverige den vanligaste orsaken till nosokomial bakteriell diarré. Cirka 30 % av antibiotika¬asso-cierad kolit/diarré orsakas av C. difficile.

C. difficile producerar åtminstone två biologiskt aktiva toxiner, A och B, som sätts i samband med C. difficile-medierad sjukdom. Toxin B är ett extremt potent cytotoxin, tusenfalt mer potent än Toxin A. De båda toxinerna orsakar svåra vävnadsskador på intestinal mukosa vilket resulterar i blodiga, vattniga diarréer. Toxinerna kan påvisas i feces och oftast kan båda toxinerna påvisas samtidigt. Cirka 25 % av C. difficile-isolat producerar ej toxin och anses då inte vara sjuk¬domsframkallande.

Sporer av C. difficile är viktiga för spridning av organismen och för recidiv av C. difficile-diarré. Sporerna är mycket resistenta mot både upphettning och desinfektionsmedel och kan överleva i miljön i månader/år och de påverkas ej av antibiotika och kan utsöndras i feces lång tid efter avslutad behandling.


Patogenes och patofysiologi

C. difficile-diarré, som betingas av inflammation i kolon, är toxinmedierad. Mängden toxin som produceras varierar mellan olika isolat. Verkningsmeka-nismerna hos C. difficile's toxiner är ej fullständigt klarlagda. Känt är att både toxin A och B binder till specifika receptorer på kolonepitelet. Båda toxinerna glukosylerar treonin på G proteiner (Rho, Rac och Cdc42) och bryter därmed proteinernas normala funktioner vilket leder till ett flertal fysiologiska föränd-ringar i enterocyterna, bl.a. kollaps av aktinskelettet. Båda toxinerna, och spe-ciellt toxin B påverkar även permeabiliteten hos tight junctions. Dessutom har toxin A kemotaktisk effekt på neutrofiler och kan aktivera enteriska neuroner och framkalla apoptos hos enterocyter. Toxinmedierade effekter blir störda epitelbarriärfunktioner, celldestruktion, genomsläppliga tight junctions och kraftig immunaktivering.

Sedan associationen mellan C. difficile och pseudomembranös kolit/antibiotika¬associerad diarré etablerades på 1970-talet har uppfattningen varit att potentiellt patogena stammar producerar både toxin A och B samtidigt, medan isolat som ej producerar toxin är icke-patogena. Vidare har ansetts att toxin A ”bereder väg” för toxin B och att toxin B ej kan orsaka tarmskada utan toxin A. Under senare år har dock toxinvariabla stammar beskrivits från olika håll i världen. Dessa stammar som producerar cytotoxin men ej enterotoxin (A-/B+) har visats kunna ge samma symtombild som stammar som producerar både toxin A och B. Sådana stammar har beräknats utgöra ca 3-13 % av det totala antalet isolat. Någon motsvarande siffra för Sverige föreligger ej. Stammar som enbart producerar toxin A har ej påvisats. Däremot har ytterligare ett toxin, "binary toxin", påvisats hos C. difficile-stammar isolerade från symtomatiska patienter. Dessa isolat har samtidigt producerat A och/eller B toxin eller varit icke-toxinproducerande (A-/B-). Betydelsen av "binary toxin" för patogenesen vid C. difficile-diarré är ännu oklar.


Symtom och klinisk bild

Sjukdomsbilden vid C. difficile-associerad diarré varierar från självläkande okomplicerad enterit till livshotande pseudomembranös kolit (PMC). Vanligtvis börjar symtomen redan under pågående antibiotikabehandling, men det kan dock dröja upp till sex veckor efter avslutad behandling innan symtom debuterar. Vid mild enterit är symtomen ospecifika och upphör oftast spontant när antibiotikabehandlingen upphör. De allvarligaste kolittillstånden karakteriseras av blodiga slemmiga diarréer med svåra vätskeförluster och elektrolytrubbningar som följd, buksmärtor, allmänpåverkan, feber och leukocytos. Vid PMC nekrotiseras tarm¬slemhinnan och det bildas vita beläggningar, s.k. pseudomembraner, bestående av döda epitelceller, vita blodkroppar och fibrin. Tarmperforation, paralytisk ileum och kolondilatation kan förekomma.


Laboratoriediagnostik

För detaljerad beskrivning, följ länken

Diagnostik av C. difficile-medierad sjukdom omfattar i första hand påvisning av toxin i feces. Referensmetod för toxindetektion är påvisning av cytotoxin, toxin B, i cellkultur.


Allmänt

Diagnostik av C. difficile-medierad sjukdom omfattar i första hand påvisning av toxin i feces. Referensmetod för toxindetektion är påvisning av cytotoxin, toxin B, i cellkultur. Flertalet cellinjer kan användas. Vissa fibroblastlinjer, t.ex. HEL-celler, reagerar på bråkdelar av picogram av C. difficile-cytotoxin. Följande indikationer för diagnostik är motiverade

  • Speciell misstanke på Clostridium difficile-medierad diarré efter, eller i sam-band med antibiotikabehandling eller annan behandling som kan tänkas rubba tarmfloran.
  • Kontroll av behandlingseffekt efter behandlad C. difficile-infektion.
  • Screening vid diarréutbrott på vårdavdelningar. Odling kan vara motiverad som komplement vid negativ toxintest men fortsatt klinisk misstanke vid epidemiologisk frågeställning.


Referensmetodik

  • Toxinbildning
    • Påvisning av Clostridium difficile cytotoxin B i cellkultur är referensmetod.
    • Semikvantitativ påvisning av Clostridium difficile cytotoxin i feces görs med hjälp av en för toxinet känslig cellinje, t.ex. humana embryonala lungfibroblas-ter (HEL). Specifikt neutraliserande C. difficile antitoxin används för verifiering.

Omsättning av prov

Prov som analyserats i cellplatta där inte den positiva och/eller negativa kontrollen fungerat sätts om.

Kvalitetskontroll

Internkontroll

C. difficile cytotoxin används vid varje analystillfälle som kontroll på cellerna. C. difficile antitoxin används vid varje neutralisationstesttillfälle som kontroll på C. difficile toxinet (positiv kontroll).


Felkällor

  • Otillräckligt med provmaterial.
  • Felaktig förvaring av provet (förvaring utan kylning före transport, under transport eller i laboratoriet före analys). En 25-faldig reduktion av cytotoxintitern sker efter 5 dygn i rumstemperatur och en 3-faldig reduktion inom 5 dygn vid förvaring i kylskåp. I frystemperatur är titern stabil.


Alternativ diagnostik

Påvisning av C. difficile toxin med Enzyme immunoassay (EIA)

Under senare år har ett flertal kommersiella tester baserade på ELISA-teknik utvecklats med vilka enbart toxin A eller både toxin A och toxin B samtidigt kan detekteras. Med kännedom om att toxin A-/B+ stammar förekommer kan tester som endast detekterar toxin A ej rekommenderas. Det har däremot diskuterats om tester som detekterar toxin A och toxin B samtidigt på sikt ska kunna anses som alternativ, eller ersätta, celltest som referensmetod. Fördelen med EIA-tester är att de är snabba, svar kan erhållas inom 3 timmar efter det att prov om¬händertagits i laboratoriet. Nackdelen är framför allt att känsligheten är lägre jämfört med referensmetoden, vilket medför att en låg toxinhalt i ett prov ej kommer att kunna detekteras.

Sensitivitet och specificitet för EIA-tester (toxin A + B) jämfört med referensmetoden varierar mellan 64 och 93 %, respektive 93 och 99 % med positiva prediktiva värden från 84 till 100 % och negativa prediktiva värden från 80 till 99 %.

Idag använder flertalet svenska laboratorier EIA-test för påvisning av C. difficile-toxin.


Analysprincip

Mikrotiterbrunnar med bottnar klädda med antikroppar riktade mot C. difficile toxin A och toxin B. Till brunnarna sätts spätt patientprov och monoklonala, enzymmärkta antikroppar riktade mot toxinerna A och B. Plattan inkuberas i värmeblock eller inkubator. Om toxinerna finns i provet bildas ett reaktivt komplex av toxin och enzymmärkta antikroppar. Efter tvättning tillsätts enzymsubstrat i form av ett färgämne och i närvaro av bundet enzym utvecklas färg i proportion till mängd bundna enzymmärkta antikroppar och därmed till mängden toxin. Stopplösning tillsätts och resultatet avläses på spektrofotometer.

EIA-testerna är enkla att utföra, alla reagenser, mikroplattor och utförlig be-skrivning inkluderas i kit-lådan. Av erfarenhet kan dock några viktiga steg sär-skilt påpekas:

  • Provet ska - oavsett konsistens - blandas noggrant innan provsättning.
  • Botten på brunnarna får ej vidröras (skador i bottenbeklädningen resulterar i felaktigt absorbansvärde).
  • Inkuberingen med enzymkonjugat bör göras på skak (minimerar antalet gränsvärden och falskt positiva resultat och förkortar dessutom testtiden).
  • Inkuberingen med substrat ska göras i mörker.
  • Utför tvättningen noga enligt beskrivningen (för att undvika hög bakgrunds¬reaktion).


Serologi

Det har visats att framför allt äldre personer med C. difficile-recidiv saknar antikroppar mot cytotoxin i blodet. Denna iakttagelse har dock ej fått praktisk användning.


Bakterieodling

Referenssubstrat

  • CCFA (cykloserin-cefoxitin-fruktos agar, se Bilaga 1.1.10), selektivt medium för primärodling.
  • Oselektivt blodhaltigt medium till anaerobodling och isolering av C. difficile.
  • Anaerob buljong för eventuell anrikning av pinnprov.


Isolering

  • Primär utodling: Kvalitativ odling på selektivt medium.
  • Fecesprov blandas med hjälp av en provtagningpinne och med pinnen görs ett primärstryk på CCFA-platta. Med platinös görs ett ganska tätt sekundärstryk över halva plattan och glesa tertiär- och kvartärstryk över den resterande halvan. CCFA-plattan inkuberas efter inokulering i anaerob miljö i totalt minst 2 dygn.
  • Pinnprov utodlas på samma sätt.

Vid eventuell anrikning inokuleras provet även i anaerob buljong. Buljongen inkuberas i minst 2 dygn och utodlas därefter på CCFA.

Anrikning är dock ej att betrakta som referensmetod.


Identifiering och minimikriterier

  • Presumtiv diagnos: Identifiering baseras på karakteristisk lukt, fluorescens och mikroskopisk och makroskopisk morfologi.
  • Preliminär avläsning: C. difficile-odling avläses under luppmikroskop (x 6 - 10). På CCFA (och andra blodhaltiga medier) växer C. difficile med grågröna, ho-mogena och delvis ut¬flytande kolonier, ca 2 mm, efter inkubering över natt och ca 4 mm efter 2 dygns inkubering. På CCFA-platta har C. difficile viss häst¬doft, men doften kommer helt till sin rätt först på oselektivt blodhaltigt medium. Un-der UV-lampa fluo¬rescerar kolonier av C. difficile chartreuse (det kan ta några sekunder innan fluorescensen uppträder). Även C. innocuum fluorescerar char-treuse, men kolo¬niutseende och morfologi förhindrar förväxling.
  • Odlingen anses som korrekt utförd om C. difficile-kontrollstammen växt.

Om odlingen inkuberats i anaerobbox görs en preliminär avläsning efter inkube-ring över natt. Vid misstänkt växt av C. difficile, eller om samtidig toxintest bedömts som positiv, tas plattan ut på laboratoriebänken och eventuella typiska kolonier isoleras till oselektivt blodhaltigt anaerob medium. Isolering inkuberas anaerobt över natt.

  • Slutlig avläsning: Slutgiltig avläsning görs under luppmikroskop efter inkube¬ring i minst 2 dygn. Om inga kolonier med typiskt utseende kan ses, bedöms odlingen som negativ.


Omsättning av prov

Prov omsätts om odlingen är negativ men samtidig toxin-test positiv, eller om den anaeroba miljön inte fungerat tillfredsställande.

  • Minimikriterier för verifiering: Isolerad stam på oselektivt blodhaltigt me¬dium har typisk kolonimorfologi och utpräglad hästdoft.

Under UV-lampa kolonier fluorescerande chartreuse. Gramfärgning visar gram-positiva stavar med ovala subterminala sporer.

Kontroll av toxinproduktion på gjorda isolat kan vara befogat.


Kvalitetskontroll

Referensstam

  • C. difficile ATCC 9689 används som internkontroll på CCFA-plattor, som jämförelse vid luppmikroskopi, som kontroll på den anaeroba miljön och som kontrollstam vid eventuell resistensbestämning.


Felkällor

  • Otillräckligt provmaterial.
  • Lång transporttid.
  • Felaktig förvaring av provet (förvaring utan kylning före transport, under transport, eller i laboratoriet före analys).
  • Frysning av provet. Vid förvaring i fryskåp sker en närmast 100-faldig reduk¬tion av antalet viabla C. difficile-organismer.
  • Felaktigt odlingsförfarande (t.ex. otillräckligt anaerob miljö, för lång tid mellan utodling och inkubering).


Epidemiologisk typning

PFGE har använts för smittspårning


Laboratorierapportering

Infektion med C. difficile är ej anmälningspliktig enligt smittskyddslagen.

REFERENSER

Arrow SA, Croese L, Bowman RA, Riley TV. Evaluation of three commersial enzyme immunoassay kits for detekting faecal Clostridium difficile toxins. J Clin Pathol 1994;7:954-956.

Brazier JS, Stubbs SL, Duerden BI. Prevalence of toxin A negative/B positive Clostridium difficile strains. J Hosp Infect 1999;42:248-249.

Ciesla WP, Bobak DA. Clostridium difficile toxins A and B are cation-depen¬dent UDP-glucose hydrolases with differing catalytic activities. J Biol Chem 1998;273:16021-16026.

Hamberg A. Utvärdering av tre enzym immuno-tester (EIA) för detektion av Clostridium difficile toxin i faeces. Examensarbete i biomedicinsk vetenskap 10 poäng. Handledare E. Holst. Vårdhögskolan i Malmö. 1997.

Holst E, Helin I, Mårdh PA. Recovery of Clostridium difficile from children. Scand J Inf. Dis 1981;13:41-45.

Karlström O, Fryklund B, Tullus K, Burman LG and the Swedish C. difficile Study group. A prospective Nationwide Study of Clostridium difficile-associated diarrhea i Sweden. Clin Inf Dis 1998;26:141-145.

Lyerly DM, Neville LM, Evans DT et al. Multicenter evaluation of Clostridium difficile TOX A/B TEST. J Clin Microbiol 1998;36:184-190.

Mattia AR, Doern GV, Clark J, Holden J, Wu L, Ferraro MJ. Comparison of four met¬hods in the diagnosis of Clostridium difficile disease. Eur J Clin Micro¬biol Infect Dis 1993;12:882-886.

Merz CS, Kramer C, Forman M et al. Comparison of four commersially avail¬able rapid enzyme immunoassays with cytotoxin assay for detection of Clostridium difficile toxin(s) from stool specimens. J Clin Microbiol 1994;32:1142-1147.

Nusrat A, von Eichel-Streiber JR, Verkade P, Madara JL, Parkos CA. Clostridium difficile toxins disrupt epithelial barrier function by altering membrane microdomain localization of tight junction proteins. Infect Immun 2001;69:1329-1336.

Riederer KM, Lawson P, Held MS, Petrylka K, Briski LE, Khatib R. Diagnosis of Clostridium difficile associated diarrhea: comparison of three rapid methods employing dif¬ferent markers for detection. Can J Microbiol 1995;41:88-91.

Rupnik M, Brazier J, Duerden B, Grabnar M, Stubbs S. Comparison of toxino¬typing and PCR ribotyping of Clostridium difficile strains and description of novel toxinotypes. Microbiology 2001;147:439-447.

Hämtad från "http://referensmetodik.folkhalsomyndigheten.se/index.php?title=Clostridium_difficile&oldid=944"