Bilaga 1 (CNS)
Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Infektioner i centrala nervsystemet
Bilaga 1
Detektion av bakterier i direktutstryk: Gramfärgning
Reagens
Initialfärgning
- Kristallviolett, stamlösning
- Kristallviolett 100 g
- (Merck art nr 15940)
- Etanol 96 % 750 mL
VARNING! Etanol är brandfarligt.
- Ammoniumoxalatlösning 1%
- Di-ammonium oxalat monohydrat (pro analysi)
Kristallviolett brukslösning Kristallviolett stamlösning 100 mL Ammoniumoxalatlösning 1% 500 mL Renat vatten, ex dest. eller FRO 400 mL (FRO=Filtered Reversed Osmosis)
Anvisning: Brukslösningen filtreras genom filtrerpapper innan den används. Förvaring: Rumstempertaur
Fixering av utstryk Lugol, bruksiösning Jodkristaller puriss 1 g Kaliumjodid (pro analysi) 2 g Renat vatten, ex dest. eller FRO 300 mL
Anvisning: Lös jodkristallerna med kaliumjodiden i vatten. Autoklaveras ej. Förvaring: Mörk flaska i rumstemperatur Avfärgning Acetonsprit Aceton (puriss) (KEBO art nr 2. 1015-1) 20 mL Etanol (96%) 80 mL Förvaring: Rumstemperatur Som alternativ kan ren etanol (96%) användas. VARNING! Mycket brandfarligt.
Kontrastfärg Karbolfuchsin stamlösning Basiskt fuchsin 8g Etanol 90% 92 g Fenol 90% 50 g Renat vatten ad l000g Hållbarhet: 3 år
Karbolfuchsin, bruksiösning: 10 mL stamlösning blandas med 90 mL renat vatten. Förvaring: Rumstemperatur
Fixering av utstryk
- Lufttorka utstryket på en plan yta.
- Fixera över låga.
- Placera alternativt några droppar metanol på objektglaset. Låt ligga 2 min. Låt kvarvarande metanol rinna av utan att skölja och låt utstryket lufttorka igen.
Färgningsprocedur
- Flöda det fixerade preparatet med kristallviolettlösning. Låt färgen ligga kvar i 30 sek. Häll av kristallviolettlösningen. Skölj bort resterande lösning med Lugols lösning och flöda sedan med mer Lugols lösning. Låt lösningen ligga kvar i 60 sek.
- Avfärga genom att låta acetonspriten flöda över utstryket medan objektglaset hålls i lutande vinkel. Sluta när ingen mer färg lossnar. Anpassa avfärgningen till tjockleken på utstryket. Skölj försiktigt bort överflöd av spritenlacetonspriten med kranvatten.
- Kontrastfärga genom att hälla på karbolfuchsin 15 sek. Skölj försiktigt bort kontrastfärgen med kranvatten. Torka objektglaset i stående position eller använd en kommersiell objektglastorkare.