Skillnad mellan versioner av "Pulsfältgelelektrofores (PFGE) av meticillinresistenta stafylokocker"

Från Referensmetodik för laboratoriediagnostik
Hoppa till navigering Hoppa till sök
 
(14 mellanliggande sidversioner av samma användare visas inte)
Rad 5: Rad 5:
 
och
 
och
  
−
''falldefinitionen [[]]''
+
''falldefinitionen [[MRSA (meticillinresistenta Staphylococcus aureus, gula stafylokocker)]]''
 
----
 
----
 
==Pulsfältgelelektrofores  (PFGE) av meticillinresistenta stafylokocker==
 
==Pulsfältgelelektrofores  (PFGE) av meticillinresistenta stafylokocker==
 
===Bakgrund===  
 
===Bakgrund===  
−
Pulsfältgelelektrofores  (PFGE) är en av de äldsta metoder för epidemiologisk som fortfarande är i bruk för att jämföra bakterieisolat då misstanke om smittspridning finns. Metoden används sedan 1990-talet för epidemiologisk typning av bland annat meticillinresistenta ''[[Staphylococcus aureus]]'' (MRSA) isolat, men intar också en central plats vid epidemiologisk typning av flera olika bakterietyper vid olika utbrottssituationer.  
+
Pulsfältgelelektrofores  (PFGE) är en av de äldsta metoderna för epidemiologisk typning som fortfarande är i bruk för att jämföra bakterieisolat då misstanke om smittspridning finns. PFGE används sedan 1990-talet och intar en central plats vid epidemiologisk typning av flera olika bakterietyper vid olika utbrottssituationer. Metoden var länge standard för typningen av meticillinresistenta ''[[Staphylococcus aureus]]'' (MRSA), men används idag huvudsakligen som en av de mest diskriminerande typningsmetoderna  vid utbrott med [[VRE]], invasiva pneumokocker och  olika arter av ''Enterobacteriaceae''. Vid kartläggning av utbrott med MRSA, framförallt med de  vanligaste [[Spa-typning av Staphylococcus aureus och MRSA|''spa''-typerna]], är komplettering med PFGE ofta användbar.  
  
−
PFGE baserar sig på att med ''restriktionsenzymer'' klyva bakteriens DNA och därefter separera DNA-fragmenten i en agarosgel. Bandmönstret i gelen analyseras sedan visuellt uppstår då som
+
För varje bakterieart måste PFGE-metoden optimeras. En av nackdelarna med PFGE är att resultaten inte är numeriska och därmed inte enkelt kommunicerbara mellan laboratorier.
  
−
Internationellt accepterade metoder för PFGE finns ....
+
Nedan beskrivs en metod för MRSA som exempel på PFGE-analys.
  
−
PFGE har som grund den ovan beskrivna metoden RFLP, men de  restriktionsenzym som används är av ett sådant slag och valda så att  betydligt färre men större fragment bildas. Fragmenten är så stora att  de måste separeras i ett särskilt instrument som cykliskt ändrar  orienteringen av det elektriska fältet under elektroforesen. 
+
===Indikation===
−
När denna metod används är det helt avgörande att utgå ifrån  intakt DNA (hela DNA-molekylen), innan klyvning sker med lämpligt  restriktionsenzym. Konventionella metoder för att isolera DNA kan därför  inte användas. I stället gjuts bakterierna in i små agarpluggar innan  cellväggarna lyseras med enzym och detergent. Frigjort DNA stabiliseras  av agarn. Agarpluggen tvättas noggrant och restriktionsenzym tillåts  därefter diffundera in i pluggen och klyva DNA. Agarpluggar med klyvt  DNA från bakterier som ska analyseras placeras i brunnarna i  agarosgelen. 
+
För att i epidemiologiskt utredningssyfte jämföra olika isolat av MRSA.
−
Nackdelen med PFGE är relativt långa arbetskrävande procedurer  för att isolera och klyva DNA. Fördelen är en enhetlig metod för  epidemiologisk typning av, i princip, alla odlingsbara bakteriearter.  Metoden används sedan 1990-talet för epidemiologisk typning av bland  annat meticillinresistenta Staphylococcus aureus (MRSA)  isolat, men intar också en central plats vid epidemiologisk typning av  flera olika bakterietyper vid olika utbrottssituationer.
 
  
−
===Indikation===
 
−
För att i epidemiologiskt utredningssyfte jämföra bakterieisolat.
 
−
 
 
===Provmaterial===
 
===Provmaterial===
−
Renkultur av stafylocker på agarplatta.
+
Renkultur av ''Staphylococcus aureus'' på agarplatta.
−
+
 
 
===Analysprincip===
 
===Analysprincip===
−
Att extrahera bakteriernas DNA och med restriktionsenzym klyva detta till mindre fragment.
+
 
−
DNA-fragmenten separeras efter storlek i agarosgel och ger för  stammen ett unikt bandmönster.
+
 
 +
Vid PFGE separeras DNA-fragment i en agarosgel med hjälp av en speciell elektroforesutrustning. Den skiljer sig från konventionell gelelektroforesutrustning genom att strömmen istället för att gå i ett jämt flöde skickas pulsvis från elektroder placerade i vinkel. PFGE möjliggör separation av stora DNA fragment och ger lätt analyserbara DNA-bandmönster. Vid PFGE gjuts bakterierna in i en agarosgelplugg i vilken DNA extraheras fram och klyvs till fragment inom lämpligt storleksområde med särskilda restriktionsenzymer. Pluggar med klyvt DNA gjuts in i en stor agarosgel som körs i PFGE-utrustningen. Efter avslutad elektrofores färgas och fotograferas gelen. Gelbilden analyseras visuellt eller med hjälp av dataprogram.
 +
 
 +
 
 +
 
 +
====Apparatur, förbrukningsmaterial och reagens====
 +
*För analysen  behövs Elektroforesutrustning för PFGE och UV-bord med kamera
 +
*Referensstam ''S. aureus'' NCTC 8325
 +
*Gjutformar till agarospluggar
 +
*Huvudsakliga reagens utgörs av LMT agaros (i EC buffert) FMC Bioproducts, Lysostaphin, Proteinase K, TEN-buffert (Tris HCl, EDTA, NaCl), EC-buffert (Trizma Hydroklorid, NaCl, Etylendiamintetraättiksyra, Polyoxyetylen 20 Cetyl Eter, N-Lauryl-sarcosin, natriumdeoxycholat, Dest vatten, Ph justerat till 7,5).
 +
*TE-buffert:(Tris HCl pH 7,6, EDTA), 10x TBE buffert (Trizma base, Borsyra H3BO3, Titriplex III (Na-EDTA), Dest vatten)
 +
*Ultra pure TM agarose Invitrogen
 +
*Restriktionsenzym ''Sma''1 med buffert
 +
*Gel Red
 
   
 
   
−
Apparatur
+
====Analyspocedur====
−
Termostat 37 och 55°C
 
−
Centrifug ≤ 12.000 x g
 
−
Pipett 1-10 µl
 
−
Pipett 1-40 µl
 
−
Pipett 40-200 µl
 
−
Pipett 200-1000 µl
 
−
Elektroforesutrustning för PFGE
 
−
UV-bord med kamera
 
−
Våg 300/3000 g
 
−
Våg 1 mg- 160  g
 
 
   
 
   
−
Förbrukningsmateriel och reagens
+
*''DNA-extraktion:'' Övernattkultur på agarplatta slammas i TEN-buffert (cirka 10<math>^9</math> bakt/mL). Efter centrifugering resuspenderas bakterierna i EC-buffert. Rören placeras i 55°C ca 15 min varefter 2 % LMT-agaros (Sigma A-9414) i EC-buffert tillsätts tillsammans med Lysostaphin. Agarosen gjuts i pluggformar med hjälp av pipett som får stelna i kylskåp.
−
Ref stam NCTC 8325
+
 
−
McFarlandrör nr 4
+
Pluggarna delas med skalpell i tre delar och till två av bitarna överförda till nytt rör tillsätts TE-buffert samt proteinase K. Inkuberas i 55°C. TE-bufferten avlägsnas varefter ny kylskåpskall buffert tillsätts repetitivt 4-5 gånger.
−
13 ml polypropylenrör
+
*'''Klyvning av DNA i agarosplugg med restriktionsenzym Sma1'''
−
Engångsplatinös
+
**1. Späd buffert (10 μL reaktionsbuffert + 90 μL dest.vatten per isolat).
−
1,5 ml centrifugrör
+
**2. Tillsätt 100 μL buffert till varje centrifugrör.
−
Engångstippar till ovanstående pipetter
+
**3. Tillsätt 1 μL Sma 1-enzym (= 1 Fast Digest Unit) till bufferten och blanda försiktigt.
−
Skalpell
+
**4. Överför en 1/3- plugg till centrifugröret.
−
Spatlar
+
**5. Blanda och inkubera i 15 minuter vid 37°C.
−
Petriskål
+
**6. De digererade pluggarna kan användas direkt eller sparas i TE-buffert tills de skall användas.
−
Gjutformar till agarospluggar
 
−
Dubbeldetsillerat DNAse och RNAse fritt vatten
 
−
1M Tris HCl pH 7,5
 
−
5 M NaCl
 
−
0,5 M EDTA pH 8,0
 
−
LMT agaros (2% I EC buffert) FMC Bioproducts
 
−
Lysostaphin 1 mg/ml i 0,05 M Tris HCl (pH 7,5)
 
−
0,15 M NaCl
 
−
Proteinase K (5mg/ml I d.d. sterilt vatten)
 
 
   
 
   
−
TEN-buffert: 100 mM Tris HCl pH 7,5
+
*'''Gjut agaros-gel /placera pluggarna i sina brunnar /starta instrumentet'''
−
                      100 mM EDTA
+
**1. Väg upp 1,5 g agaros,Ultrapure TM Invitrogen. Smält i 150 mL 0,5 x TBE-buffert
−
                      150 mM NaCl
+
**2. Låt svalna ca 56°C. Häll agarosen i gjutformen. Låt stelna ca. 1 tim.
 +
**3. Överför de enzymkluvna pluggarna till brunnarna i gelen. Förslut genom att droppa på smält agarose. Pluggar från referensstammen placeras jämnt fördelat i gelen.
 +
**4. Tillred PFGE-buffert (75 ml TBE-buffert (10x konc) + 2,2 L vatten.)
 +
**5. Häll bufferten i PFGE-apparaten. Ställ in kylaggregatet på 14°C och starta detta.
 +
**6. Placera gelen på plats då buffert-temperaturen är 14°C.
 +
**7. Starta elforesaggregatet. Ställ in program som ger 6 V/cm i 23 tim, vinkel 120 grader, initial omslagsstid 5.0 sek, slutlig omslagastid 60 sek, linjär ramp.
 +
**8. Gelen infärgas med gel-red e. dyl. och fotograferas. Gelbilden analyseras.
 +
 
 +
====Analys av bandmönster====
 +
Isolatens bandmönster jämförs och grad av genetisk likhet analyseras för att styrka/utesluta möjliga epidemiologiska samband.
 +
 
 +
Om bandmönstren inte går att särskilja eller avviker i <3 bandpositioner, bedöms bakterieisolaten som sannolikt tillhörande ett utbrott alternativt ha ett gemensamt ursprung. Skiljer bandmönstren i >3 men <7 positioner bedöms bakterieisolaten som möjligen tillhörande ett utbrott eller ha ett gemensamt ursprung. Om bandmönstren skiljer i >7 band, vilket oftast innebär att cirka 50 % av banden är av olika storlek, anses inte isolaten ha någon gemensam källa.
 
   
 
   
−
EC-buffert:  Trizma Hydroklorid 0,95 g
+
Observera att det inte finns några absoluta gränser för avvikelsernas antal enligt ovan, och slutbedömningen bör helst vägas mot övriga epidemiologiska data.
−
                      NaCl 58,4g
+
 
−
Etylendiamintetraättiksyra 29,2 g
+
==REFERENSER==
−
Polyoxyetylen 20 Cetyl Eter 5 g
+
*1. Goering RV. Pulsed field gel electrophoresis: A review of application and interpretation in the molecular epidemiology of infectious disease. Infection, genetics and evolution, 2010;10:866-875
−
N-Lauryl-sarcosin 5 g
+
*2. Tenover FC et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by Pulsed Field Gel Electrophoresis: Criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol, 1995; 33:2233-2239
−
Natriumdeoxycholat 2 g
 
−
Dest vatten ca 800 ml
 
−
Ph justeras med ca 50 ml 5 M NaOH till 7,5
 
−
 
−
TE-buffert:  10  mM Tris HCl pH 7,6
 
−
1mM EDTA
 
−
                     
 
−
 
−
10x TBE buffert:
 
−
Trizma base 108 g
 
−
                      Borsyra H3BO3 55,65 g
 
−
                      Titriplex III (Na-EDTA) 7,44 g
 
−
                      Dest vatten till 1000 ml
 
−
 
−
Ultra pure TM agarose Invitrogen
 
−
Restriktionsenzym Sma 1 med buffert
 
−
Gel Red
 
−
 
−
Analyspocedur
 
−
 
−
DNA extraktion
 
−
 
−
Över      natt kultur bakterier på agarplatta slammas i 500 µl TEN-buffert till      täthet 1x 109 bakt/ml i centrifugrör, centrifugeras 10 sek x 7000      x g, dekanteras och resuspenderas i 125 µl EC-buffert. Rören placeras i 55°C ca 15 min.Tillsätt      125 µl 55°C      2% LMT-agaros (Sigma A-9414) i EC-buffert. Tillsätt 12 µl 1 mg/ml lysostaphin,      blanda väl genom att pipettera upp o ner några gånger och gjut agarosen i      pluggformar med hjälp av pipett.Låt      pluggarna stelna i +4°C      10-15 min.Placera      pluggarna från respektive isolat i ett centrifugrör. Oftast gjuts två      pluggar /isolat, med 1 ml EC-buffert och inkubera i 37°C.Dela      en av pluggarna med skalpell i tre delar. Två av bitarna överförs till      nytt rör och 250 µl TE-buffert samt 25 µl proteinase K (5 mg/ml)      tillsätts. Inkubera 1 timma 55°C.Avlägsna      bufferten och tillsätt ny kylskåpskall TE-buffert och detta upprepas 4-5      ggr med 10 min mellanrum. Förvara pluggarna i kyl mellan tvättarna.      Pluggarna kan sparas i kyl i 4 °C någon vecka.
 
−
 
−
Klyvning av DNA i agarosplugg med restriktionsenzym Sma 1
 
−
 
−
1. Späd buffert (10 μl reaktionsbuffert + 90 μl dest.vatten per isolat).
 
−
2. Tillsätt 100 μl av ovanstående buffert till varje centrifugrör.
 
−
3. Tillsätt 1 μl enzym (= 1Fast Digest Unit) till bufferten och blanda försiktigt.
 
−
4. Överför en 1/3- plugg till centrifugröret.
 
−
5. Blanda försiktigt och inkubera i 15 minuter vid 37°C.
 
−
6. De digererade pluggarana kan användas direkt eller sparas i TE-buffert tills de skall användas.
 
−
 
−
Gjut agaros-gel /placera pluggarna i sina brunnar /starta instrumentet
 
−
1. Väg upp 1,5 g agaros,Ultrapure TM Invitrogen. Smält i 150 ml 0,5 x TBE-buffert
 
−
2. Låt svalna ca 56°C. Häll agarosen i gjutformen. Låt stelna ca. 1 tim.
 
−
3. Överför de enzymkluvna pluggarna till brunnarna i gelen. Förslut genom att droppa på smält agarose. Pluggar från referensstammen placeras jämnt fördelat i gelen. Om gel med 15 brunnar används placeras klyvningar från referensstammen lämpligen i brunn nr 2, 8 och 14.
 
−
 
−
4. Tillred PFGE-buffert (75 ml TBE-buffert (10x konc) + 2,2 l vatten.)
 
−
5. Häll bufferten i PFGE-apparaten. Ställ in kylaggregatet på 14°C och starta detta.
 
−
6. Placera gelen på plats då buffert-temperaturen är 14°C.
 
−
7. Starta elforesaggregatet. Ställ in program som ger 6 V/cm i 23 tim, vinkel 120 grader, initial omslagsstid 5.0 sek, slutlig omslagastid 60 sek, linjär ramp.
 
−
8. Gelen infärgas med gel-red e. dyl. och fotograferas. Banden analyseras.
 
 
[[Kategori:Molekylärbiologisk diagnostik]]
 
[[Kategori:Molekylärbiologisk diagnostik]]
−
[[KAtegori:Smittskyddslagens sjukdomar]]
+
[[Kategori:Smittskyddslagens sjukdomar]]

Nuvarande version från 17 januari 2013 kl. 12.28

Artikel under utarbetande april 2012. Innehållet är preliminärt i väntan på konsensusförfarande

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Molekylärbiologisk diagnostik

och

falldefinitionen MRSA (meticillinresistenta Staphylococcus aureus, gula stafylokocker)

Pulsfältgelelektrofores (PFGE) av meticillinresistenta stafylokocker[redigera]

Bakgrund[redigera]

Pulsfältgelelektrofores (PFGE) är en av de äldsta metoderna för epidemiologisk typning som fortfarande är i bruk för att jämföra bakterieisolat då misstanke om smittspridning finns. PFGE används sedan 1990-talet och intar en central plats vid epidemiologisk typning av flera olika bakterietyper vid olika utbrottssituationer. Metoden var länge standard för typningen av meticillinresistenta Staphylococcus aureus (MRSA), men används idag huvudsakligen som en av de mest diskriminerande typningsmetoderna vid utbrott med VRE, invasiva pneumokocker och olika arter av Enterobacteriaceae. Vid kartläggning av utbrott med MRSA, framförallt med de vanligaste spa-typerna, är komplettering med PFGE ofta användbar.

För varje bakterieart måste PFGE-metoden optimeras. En av nackdelarna med PFGE är att resultaten inte är numeriska och därmed inte enkelt kommunicerbara mellan laboratorier.

Nedan beskrivs en metod för MRSA som exempel på PFGE-analys.

Indikation[redigera]

För att i epidemiologiskt utredningssyfte jämföra olika isolat av MRSA.

Provmaterial[redigera]

Renkultur av Staphylococcus aureus på agarplatta.

Analysprincip[redigera]

Vid PFGE separeras DNA-fragment i en agarosgel med hjälp av en speciell elektroforesutrustning. Den skiljer sig från konventionell gelelektroforesutrustning genom att strömmen istället för att gå i ett jämt flöde skickas pulsvis från elektroder placerade i vinkel. PFGE möjliggör separation av stora DNA fragment och ger lätt analyserbara DNA-bandmönster. Vid PFGE gjuts bakterierna in i en agarosgelplugg i vilken DNA extraheras fram och klyvs till fragment inom lämpligt storleksområde med särskilda restriktionsenzymer. Pluggar med klyvt DNA gjuts in i en stor agarosgel som körs i PFGE-utrustningen. Efter avslutad elektrofores färgas och fotograferas gelen. Gelbilden analyseras visuellt eller med hjälp av dataprogram.


Apparatur, förbrukningsmaterial och reagens[redigera]

  • För analysen behövs Elektroforesutrustning för PFGE och UV-bord med kamera
  • Referensstam S. aureus NCTC 8325
  • Gjutformar till agarospluggar
  • Huvudsakliga reagens utgörs av LMT agaros (i EC buffert) FMC Bioproducts, Lysostaphin, Proteinase K, TEN-buffert (Tris HCl, EDTA, NaCl), EC-buffert (Trizma Hydroklorid, NaCl, Etylendiamintetraättiksyra, Polyoxyetylen 20 Cetyl Eter, N-Lauryl-sarcosin, natriumdeoxycholat, Dest vatten, Ph justerat till 7,5).
  • TE-buffert:(Tris HCl pH 7,6, EDTA), 10x TBE buffert (Trizma base, Borsyra H3BO3, Titriplex III (Na-EDTA), Dest vatten)
  • Ultra pure TM agarose Invitrogen
  • Restriktionsenzym Sma1 med buffert
  • Gel Red

Analyspocedur[redigera]

  • DNA-extraktion: Övernattkultur på agarplatta slammas i TEN-buffert (cirka 10 bakt/mL). Efter centrifugering resuspenderas bakterierna i EC-buffert. Rören placeras i 55°C ca 15 min varefter 2 % LMT-agaros (Sigma A-9414) i EC-buffert tillsätts tillsammans med Lysostaphin. Agarosen gjuts i pluggformar med hjälp av pipett som får stelna i kylskåp.

Pluggarna delas med skalpell i tre delar och till två av bitarna överförda till nytt rör tillsätts TE-buffert samt proteinase K. Inkuberas i 55°C. TE-bufferten avlägsnas varefter ny kylskåpskall buffert tillsätts repetitivt 4-5 gånger.

  • Klyvning av DNA i agarosplugg med restriktionsenzym Sma1
    • 1. Späd buffert (10 μL reaktionsbuffert + 90 μL dest.vatten per isolat).
    • 2. Tillsätt 100 μL buffert till varje centrifugrör.
    • 3. Tillsätt 1 μL Sma 1-enzym (= 1 Fast Digest Unit) till bufferten och blanda försiktigt.
    • 4. Överför en 1/3- plugg till centrifugröret.
    • 5. Blanda och inkubera i 15 minuter vid 37°C.
    • 6. De digererade pluggarna kan användas direkt eller sparas i TE-buffert tills de skall användas.
  • Gjut agaros-gel /placera pluggarna i sina brunnar /starta instrumentet
    • 1. Väg upp 1,5 g agaros,Ultrapure TM Invitrogen. Smält i 150 mL 0,5 x TBE-buffert
    • 2. Låt svalna ca 56°C. Häll agarosen i gjutformen. Låt stelna ca. 1 tim.
    • 3. Överför de enzymkluvna pluggarna till brunnarna i gelen. Förslut genom att droppa på smält agarose. Pluggar från referensstammen placeras jämnt fördelat i gelen.
    • 4. Tillred PFGE-buffert (75 ml TBE-buffert (10x konc) + 2,2 L vatten.)
    • 5. Häll bufferten i PFGE-apparaten. Ställ in kylaggregatet på 14°C och starta detta.
    • 6. Placera gelen på plats då buffert-temperaturen är 14°C.
    • 7. Starta elforesaggregatet. Ställ in program som ger 6 V/cm i 23 tim, vinkel 120 grader, initial omslagsstid 5.0 sek, slutlig omslagastid 60 sek, linjär ramp.
    • 8. Gelen infärgas med gel-red e. dyl. och fotograferas. Gelbilden analyseras.

Analys av bandmönster[redigera]

Isolatens bandmönster jämförs och grad av genetisk likhet analyseras för att styrka/utesluta möjliga epidemiologiska samband.

Om bandmönstren inte går att särskilja eller avviker i <3 bandpositioner, bedöms bakterieisolaten som sannolikt tillhörande ett utbrott alternativt ha ett gemensamt ursprung. Skiljer bandmönstren i >3 men <7 positioner bedöms bakterieisolaten som möjligen tillhörande ett utbrott eller ha ett gemensamt ursprung. Om bandmönstren skiljer i >7 band, vilket oftast innebär att cirka 50 % av banden är av olika storlek, anses inte isolaten ha någon gemensam källa.

Observera att det inte finns några absoluta gränser för avvikelsernas antal enligt ovan, och slutbedömningen bör helst vägas mot övriga epidemiologiska data.

REFERENSER[redigera]

  • 1. Goering RV. Pulsed field gel electrophoresis: A review of application and interpretation in the molecular epidemiology of infectious disease. Infection, genetics and evolution, 2010;10:866-875
  • 2. Tenover FC et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by Pulsed Field Gel Electrophoresis: Criteria for bacterial strain typing. J Clin Microbiol, 1995; 33:2233-2239
Hämtad från "http://referensmetodik.folkhalsomyndigheten.se/index.php?title=Pulsfältgelelektrofores_(PFGE)_av_meticillinresistenta_stafylokocker&oldid=12669"