Skillnad mellan versioner av "Spa-typning av Staphylococcus aureus och MRSA"

Versionen från 2 april 2012 kl. 08.03

Sida under bearbetning april 2012. Innehåll ej godkänt

Spa-typning av Staphylococcus aureus och MRSA

Bakgrund

Vid Spa-typning analyseras genom sekvensering den polymorfa variabla regionen X i protein A genen (spa). Genen finns hos alla bakterier av arten S. aureus och kodar för protein A på cellytan. X-regionen består av ett variabelt antal 24 basparsrepetitioner flankerat av väl konserverade regioner. Spa-typning drar nytta av tekniska fördelar som snabbhet och reproducerbarhet och den är också på ett enkelt sätt kommunicerbar. Typning är enkel men kräver apparatur för DNA-sekvensering.

Det finns en internationellt erkänd nomenklatur där resultatet av spa-typning uttrycks enligt ett system som utarbetats viduniversitetet i Münster i Tyskland och som nu används av alla länder i Europa. För ändamålet finns en väl underhållen internetbaserad global databas (StaphType, RidomSpaServer.ridom.de) som underlättar det epidemiologiska arbetet och möjliggör också jämförelser mellan länderna.

Numera utförs i första hand så kallad spa-typning för kartläggning av smitta med S. aureus och MRSA. I vissa sammanhang, framför allt i samband med internationella jämförelser, kan även multi locus secquence typing (MLST), användas. För att säkrare kunna kartlägga ett utbrott, framförallt med de vanligaste Spa-typerna, kan komplettering med PFGE vara användbar. I Sverige är spa-typerna t002, t008 och t044 vanligast med över 100 isolat vardera under år 2008. De tio vanligaste typerna står för cirka 50 procent av de svenska fallen.

Utförande

För utförandet behövs PCR-instrument, sekvenseringsinstrument och programvaran Ridom StaphType (Ridom GmbH)

Utgångsmaterial är kolonier av S. aurues- eller MRSA-isolat på agarplatta. DNA extraheras med gängse metodik. Vanligen används lysostaphin i rumstemperatur följt av proteinase K vid 56° C. därefter inkuberas provet 15 min. 95° C varefter templatet späs 1/100 i vatten.

Nukleinsyraamplifiering görs med följande primrar

Primer SPA 1113f sekvens; 5’ TAA AGA CGA TCC TTC GGT GAG C 3’
Primer SPA 1514r sekvens; 5’ CAG CAG TAG TGC CGT TTG CTT 3’

Mix/PCR-rör

Mastermix för 24 prov
- 24 µL, 10 pmol/µL SPA 1113f
- 24 µL, 10 pmol/µl SPA 1514r
- 120 µL, reaktionsbuffert x 10 Taq enzym dilution
- 6 µL, 5U/µl Taq DNA polymeras
- 96 µL, 10mM dNTP/dUTP mix (Fermentas)
- 72 µL, 30 mM MgCl2
- 615 µL destillerat sterilt DNase och RNase fritt vatten

Till varje PCR-kapillärrör sätts 10 µL färdigberett templat 10 pg/µL.

PCR-program för amplifiering av nukleinsyra

10 min 80°C
35 cycler omfattande 45 sek 94°C, 45 sek 60°C och 90 sek 72°C
programmet avslutas med en cycel 10 min 72°C.

PCR-produkt renas därefter från ej inkorporerade primrar och dNTP. Exempelvis kan QIAquick PCR purification Kit användas enligt tillverkarens rekommendationer.

Sekvensering av PCR-produkten

Inmärkning görs i 0,2 mL microrör
- 4 µL Primer SPA 1113f
- 4 µL BigDye Terminator ready reaction cycle sequencing kit 1.1 (Life technologiesTM)
- 2 µL reaktionsbuffert
- 3 µL mål-DNA (PCR-produkt från ovanstående reaktion)
- 7 µL vatten

PCR-programmets utformning vid inmärkning för sekvensering

25 cycler; 15 sek 96°C, 10 sek 50°C och 4 min 60°C därefter 5 sek 60°C och 60 sek 15°C

Inmärkt PCR-produkt renas därefter inför sekvenseringen. I ett första steg fälls den inmärkta produkten med NaAc och 95%-ig etanol och värms i 90°C. Efter centifugering tvättas pelleten i 70%-ig etanol som avlägsnas, i ett sista steg genom indunstning vid 90°C. Den nu renade produkten blandas med formamid, centrifugeras, värms i 90°C och ställs sedan kortvarigt på frysblock. Därefter överförs produkten till ett sekvenseringsrör.

Analys av sekvenseringsresultatet

Sekvensen analyseras med programvaran Ridom StaphType (Ridom GmbH) och den aktuella stammen erhåller på så sätt ett SPA - nummer.

@@ Rad 11: / Rad 11: @@
 ===Utförande===
 För utförandet behövs PCR-instrument, sekvenseringsinstrument och programvaran Ridom StaphType (Ridom GmbH)
+Utgångsmaterial är kolonier av ''S. aurues''- eller MRSA-isolat på agarplatta. DNA extraheras med gängse metodik. Vanligen används ''lysostaphin'' i rumstemperatur följt av ''proteinase K'' vid 56° C. därefter inkuberas provet 15 min. 95° C varefter templatet späs  1/100 i vatten.
-Förbrukningsmaterial
+Nukleinsyraamplifiering görs med följande primrar
-Pipettspetsar
-Transferpipett
-,5 ml centrifugrör
-Filtertips 20 μl
-Filtertips 100 μl
-Filtertips 200 μl
-Filtertips 1000μl
-Distilled Water DNase/RNase free (Gibco)
-PCR tubes 0,2 ml
-”Sample tubes” 0,5 ml
-Septa till ”Sample tubes”
-POP 6, acrylamid-gel
-cm sekvenserings-kapillär
-Reagenser
+*Primer SPA 1113f sekvens; 5’ TAA AGA CGA TCC TTC GGT GAG C 3’
+*Primer SPA 1514r sekvens; 5’ CAG CAG TAG TGC CGT TTG CTT 3’
+====Mix/PCR-rör====
+*Mastermix för 24 prov
+**24 µL, 10 pmol/µL SPA 1113f
+**24 µL, 10 pmol/µl SPA 1514r
+**120 µL, reaktionsbuffert x 10 Taq enzym dilution
+**6 µL, 5U/µl Taq DNA polymeras
+**96 µL, 10mM dNTP/dUTP mix (Fermentas)
+**72 µL, 30 mM MgCl2
+**615 µL destillerat sterilt DNase och RNase fritt vatten
-Lysostaphin 100 μg/ml i 50 mM Tris
-proteinase K 5 mg/ml
-Primer SPA 1113f sekvens; 5’ TAA AGA CGA TCC TTC GGT GAG C 3’
-Primer SPA 1514r sekvens; 5’ CAG CAG TAG TGC CGT TTG CTT 3’
-Taq (DNA) polymerase
-Reaktionsbuffert 10 x
-dNTP/dUTP mix
-mM MgCl2
-BigDye Terminator ready reaction cycle sequencing kit (Life technologiesTM)
-M NaAc
-% etanol
-% etanol
+Till varje PCR-kapillärrör sätts 10 µL färdigberett templat 10 pg/µL.
-====Analysprocedur====
+====PCR-program för amplifiering av nukleinsyra====
+*10 min 80°C
+*35 cycler omfattande 45 sek 94°C, 45 sek 60°C och 90 sek 72°C
+*programmet avslutas med en cycel 10 min 72°C.
-DNA-extraktion av ''S. aureus'' från stam på agarplatta
+PCR-produkt renas därefter från ej inkorporerade primrar och dNTP. Exempelvis kan QIAquick PCR purification Kit användas enligt tillverkarens rekommendationer.
-. Slamma 4-10 kolonier med engångsplatinös i 100 μl 100 μg/ml lysostaphin i 1,5 ml eppendorfrör. Inkubera minst 30 min vid 37° C.
+===Sekvensering av PCR-produkten===
-. Tillsätt 4 μl proteinase K 5 mg/ml, inkubera minst 30 min. vid 56° C.
-. Inkubera provet 15 min. 95° C. Späd provet 1/100 i vatten. Provet är nu klart för PCR-analys.
-====PCR-amplifiering====
+*Inmärkning görs i 0,2 mL microrör
+**4 µL Primer SPA 1113f
+**4 µL BigDye Terminator ready reaction cycle sequencing kit 1.1 (Life technologiesTM)
+**2 µL reaktionsbuffert
+**3 µL mål-DNA (PCR-produkt från ovanstående reaktion)
+**7 µL vatten
-Mastermix för 24 prov
-µl, 10 pmol/µl SPA 1113f
-µl, 10 pmol/µl SPA 1514r
-µl, reaktionsbuffert x 10 Taq enzym dilution
-µl, 5U/µl Taq DNA polymeras
-µl, 10mM dNTP/dUTP mix (Fermentas)
-µl, 30 mM MgCl2
-µl destillerat sterilt DNase och RNase fritt vatten
+====PCR-programmets utformning vid inmärkning för sekvensering====
+*25 cycler; 15 sek 96°C, 10 sek 50°C och 4 min 60°C därefter 5 sek 60°C och 60 sek 15°C
-Till varje PCR-kapillärrör sätts 10 µl templat dvs DNA-extrakt från ''S. aureus''  10 pg/µl.
+Inmärkt PCR-produkt renas därefter inför sekvenseringen. I ett första steg fälls den inmärkta produkten med NaAc och 95%-ig etanol och värms i 90°C. Efter centifugering tvättas pelleten i 70%-ig etanol som avlägsnas, i ett sista steg genom indunstning vid 90°C. Den nu renade produkten blandas med ''formamid'', centrifugeras, värms i 90°C och ställs sedan kortvarigt på frysblock. Därefter överförs produkten till ett sekvenseringsrör.
-PCR-programmets utformning vid amplifiering:
+====Analys av sekvenseringsresultatet====
-Inledningsvis 10 min 80°C, därefter 35 cycler omfattande 45 sek 94°C, 45 sek 60°C och 90 sek 72°C, programmet avslutas med en cycel 10 min 72°C.
+Sekvensen analyseras med programvaran Ridom StaphType (Ridom GmbH) och den aktuella stammen erhåller på så sätt ett SPA - nummer.
-Rening av PCR-produkt från ej inkorporerade primrar och dNTP.
+[[Kategori:Smittskyddslagens sjukdomar]]
+[[Kategori:Molekylärbiologisk diagnostik]]
-Använd QIAquick PCR purification Kit enligt tillverkarens rekommendationer.
-Sekvensering av PCR-produkten
- Inmärkning sker i 0,2 ml microrör
-µl Primer SPA 1113f
-µl BigDye Terminator ready reaction cycle sequencing kit 1.1 (Life technologiesTM)
-µl reaktionsbuffert
-µl mål-DNA (PCR-produkt från ovanstående reaktion)
-µl vatten
-PCR-programmets utformning vid inmärkning för sekvensering:
-cycler; 15 sek 96°C, 10 sek 50°C och 4 min 60°C därefter 5 sek 60°C och 60 sek 15°C
-Rening av inmärkt PCR-produkt inför sekvensering
-. 2 μl 3M NaAc samt 50 μl 95%-ig etanol sätts till den inmärkta produkten.
-Blanda försiktigt, för över till 0,2 ml centrifugrör och låt stå och fälla 20 min i
-rumstemp. Sätt på 90°C värmeblock.
-. Centrifugera 16.000 x g minst 20 min och avlägsna supernatanten.
-Sätt till 250 μl 70%-ig etanol för att tvätta pelleten och blanda försiktigt.
-. Centrifugera 16.000 x g minst 5 min och sug försiktigt bort supernatanten
-med en filtertipp. Torka försiktigt ur röret med en bomullspinne.
-. Sätt rören med öppna lock i 90°C värmeblock 2,5 min för att avdunsta spriten.
-Låt stå och svalna på bänken 10 min.
-. Tillsätt 15 μl formamid till rören, blanda försiktigt och centrifugera ned snabbt.
-Värm proven 90°C 2,5 min. Ställ dem genast i ett frysblock 2 min. och för
-sedan över provet till ett 0,5 ml sekvenseringsrör. Sätt på septan och placera röret
-i ett för sekvensering speciellt provrörsställ.
-Provet är nu redo för sekvensering!
-Analys av sekvenseringsresultatet
-Sekvensen analyseras med programvaran Ridom StaphType (Ridom GmbH) och den aktuella stammen erhåller på så sätt ett SPA - nummer