Andra metoder för molekylärepidemiologisk typning

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Molekylärbiologisk diagnostik

---

Andra metoder för molekylärepidemiologisk typning

Vid utbrott av infektionssjukdomar rör det sig ofta om smitta av mikroorganismer med gemensamt ursprung. Ofta är de här mikroorganismerna klonala, dvs de är avkomma från en enda cell och är därför genetiskt identiska, eller näst intill identiska, till denna ursprungscell. Tanken om ett klonalt samband mellan isolat av mikroorganismer från ett utbrott med gemensam källa är viktig vid epidemiologiska utredningar av infektionssjukdomar.

Epidemiologisk typning har många applikationer inom klinisk mikrobiologi som bedrivs på våra sjukhuslaboratorier. Typningen är nödvändig för att säkerställa om tidigare identifierade virulenta kloner finns närvarande i samhället, för att identifiera utbrottssituationer eller för att identifiera källan till utbrottet.

Ett flertal nukleinsyrabaserade metoder finns att tillgå för molekylärepidemiologiska typningar. Vilken metod som väljs beror bland annat på vilken mikroorganism som ska subtypas. Nedan beskrivs några av de vanligaste typningsmetoderna.

Restriction fragment length polymorphisms (RFLP)

RFLP-typning bygger på jämförelse av storleken av och antalet fragment som producerats efter digerering (klyvning) av bakteriernas nukleinsyra med ett restriktionsenzym. Enzymet klyver DNA i exakta positioner definierade av den inbördes ordningen av vanligen 4-6 baspar (bp). Restriktionsenzym har hög specificitet och fullständig digerering av nukleinsyran ger ett reproducerbart antal DNA-fragment. Fragmenten, oftast i storleken 1000 – 20.000 bp, kan separeras genom agarosgelelektrofores och visualiseras med hjälp av etidiumbromid i UV-ljus. Ett för bakterieklonen unikt mönster avseende antal och storlek av DNA-fragment produceras. Nackdelen är att ett mycket stort antal fragment produceras, vilket kan medföra tolkningssvårigheter. Metoden lämpar sig därför bara till att jämföra ett mindre antal stammar, inte till storskaliga analyser.

Ett sätt att komma runt RFLP-metodens begränsningar är att utnyttja hybridiserings- och probetekniker. De producerade DNA-fragmenten överförs då genom så kallad Southern blotting från agarosgelen till nitrocellulosa- eller nylon-membran. Därefter visualiseras ett mindre antal av fragmenten, nämligen de som hybridiserar med en märkt oligonukleotid, en så kallad probe. Oligonukleotiden kan vara av olika slag baserad på specifika virulensfaktorer eller slumpvis valda. En särskild typ av prober utgörs av hela eller delar av genen som kodar för 16S eller 23S rRNA och metoden kallas då ribotypning.

RFLP används framför allt vid epidemiologisk typning av Mycobacterium tuberculosis. I USA och Europa har nätverk genom databaser för IS6110-hybridisering organiserats. IS står för insertionselement och är en sekvens som kan förekomma i 1-25 repetitioner i genomet hos M. tuberculosis. Skillnader i IS-elementens placering varierar dessutom från stam till stam vilket ger en relativt hög diversitet och därmed metoden ökad diskriminerande förmåga.

Pulsfältgelelektofores (PFGE)

PFGE har som grund den ovan beskrivna metoden RFLP, men de restriktionsenzym som används är av ett sådant slag och valda så att betydligt färre men större fragment bildas. Fragmenten är så stora att de måste separeras i ett särskilt instrument som cykliskt ändrar orienteringen av det elektriska fältet under elektroforesen.

När denna metod används är det helt avgörande att utgå ifrån intakt DNA (hela DNA-molekylen), innan klyvning sker med lämpligt restriktionsenzym. Konventionella metoder för att isolera DNA kan därför inte användas. I stället gjuts bakterierna in i små agarpluggar innan cellväggarna lyseras med enzym och detergent. Frigjort DNA stabiliseras av agarn. Agarpluggen tvättas noggrant och restriktionsenzym tillåts därefter diffundera in i pluggen och klyva DNA. Agarpluggar med klyvt DNA från bakterier som ska analyseras placeras i brunnarna i agarosgelen.

Nackdelen med PFGE är relativt långa arbetskrävande procedurer för att isolera och klyva DNA. Fördelen är en enhetlig metod för epidemiologisk typning av, i princip, alla odlingsbara bakteriearter. Metoden används sedan 1990-talet för epidemiologisk typning av bland annat MRSA (separat artikel)-isolat, men intar också en central plats vid epidemiologisk typning av flera olika bakterietyper vid olika utbrottssituationer.

PCR-baserad epidemiologisk typning

Random amplified polymorphic DNA (RAPD)- eller arbitrarily primed (AP)- PCR är exempel på typning med hjälp av PCR. Normalt bygger PCR på kännedom om den aktuella målsekvensen för design av primrar. För RAPD används emellertid primrar som inte designats utifrån målsekvensen. Primrarna är korta (10 baser) och binder slumpmässigt på flertalet ställen till det bakteriella genomet. De primrar som bundit inom några hundra basers avstånd på motsatta DNA-trådar kan generera DNA-fragment som tillsammans ger ett mönster unikt för en viss stam. Metoden har använts för epidemiologisk typning av en mängd olika agens och som exempel kan nämnas streptokocker, Salmonella och Legionella.

Man kan också välja primrar riktade mot kända sekvenser, ofta repetitioner, i genomet. Repetitive extragenic palindromic (REP)-PCR utnyttjar den här typen av primrar och har framgångsrikt använts för epidemiologisk typning av i synnerhet gramnegativa bakterier tex Escherichia coli, Salmonella och Pseudomonas. Hos många grampositiva bakterier återfinns en annan repetitiv DNA-sekvens, BOX element, först identifierat hos Streptococcus pneumoniae. BOX-elementen består av varierande kombinationer av 3 subenheter, boxA, boxB och boxC. Subenheten boxA verkar vara konserverad hos ett antal olika bakteriearter medan de två övriga subenheterna bara återfinns hos S. pneumoniae.

Multiple locus VNTR analysis (MLVA), där VNTR står för variable number tandem repeats. Metoden innebär detektion av områden med repeterade sekvenser där antalet repetitioner i varje område beräknas. Vanligt är att omkring tio primerpar används för PCR-detektion av lika många loci som i sin tur innehåller varierande antal repetitioner hos stammar med olika ursprung. PCR-reaktionerna kan utföras som singelreaktioner och resultatet analyseras därefter på agarosgel och storleksbestäms för att antalet repetitioner ska kunna beräknas. För PCR-reaktionerna kan också inmärkta primrar användas och flera av reaktionerna kan då utföras i samma PCR-rör så kallad multiplex PCR. För storleksbestämning av de bildade DNA-fragmenten och för beräkning av antalet repetitioner används i det här fallet oftast någon form av sekvensutrustning som kan detektera och storleksbestämma DNA med inmärkta primrar. MLVA är en i sammanhanget relativt ny teknik som sannolikt är på frammarsch. Exempel på bakteriearter som typats epidemiologiskt med den här tekniken är Mycobacterium tuberculosis (tekniken kallas då MIRU-VNTR), Pseudomonas aeruginosa och Escherichia coli.

Epidemiologisk typning via sekvensering

Single locus sequence typing (SLST) baseras på sekvensering av ett locus. Spa-typning av Staphylococcus aureus och MRSA är exempel på SLST. Vid spa-typning sekvenseras en del av protein A-genen, som hos olika stammar av S. aureus innehåller olika antal repetitioner (vanligtvis 3-15), med ett visst mått av mutationer. Metoden har främst kommit att användas för MRSA.

Multi locus sequence typing (MLST) innebär att flera loci hos bakterieisolatet sekvenseras och slutsatser kan därefter dras kring klonalitet och släktskap. Gener som analyseras är oftast så kallade ”housekeeping genes”, dvs hushållningsgener som inte förändras särskilt mycket. MLST ger därför oftast en relativt grov analys av det epidemiologiska läget vid analys av bakterier och används främst vid frågeställningar av global karaktär och används således sällan i det korta tidsperspektivet i tex utbrottssituationer.

Tolkning och klinisk nytta

För flertalet av ovanstående metoder för epidemiologisk typning, används vanligen någon form av mjukvara och databearbetning för att bilda dendrogram, släktskapsträd, och på så sätt avgöra släktskap mellan olika stammar. I den akuta utbrottssituationen är sådan mjukvara till stor hjälp, i synnerhet om ett stort antal isolat behöver analyseras. Däremot kan det vara tveksamt hur stor vikt man kan och bör lägga vid epidemiologiska typningar i ett längre tidsperspektiv och beror framför allt på vilken bakterieart som studeras. Bakteriearter som tex streptokocker och meningokocker, som kan ta upp större mängd genetiskt material från andra kloner av samma art, kan ge svårbedömt PFGE-resultat i ett längre tidsperspektiv. För E. coli och S. aureus är kunskapen och erfarenheten emellertid större och därmed kan mer långtgående slutsatser kring spridning av smitta dras.

PCR-baserade typningsmetoder, som exempelvis RAPD, lämpar sig särskilt väl i det korta perspektivet och vid begränsade, mindre, utbrott. Eftersom metoderna till viss del bygger på slumpmässig basparning mellan primrar och målsekvenser är metoden svår att göra så robust att samma resultat erhålls över tid och mellan olika laboratorier.

DNA-typning som bygger på analys av repeterat genetiskt material kan vara svårt att bedöma relevansen av, både på kort och på lång sikt. I dagsläget behöver tex MLVA valideras ytterligare för att säkerställa dess pålitlighet över tid. Locus innehållande repeterade nukleotidsekvenser är bland de mest variabla regionerna i bakteriella genom. Förändringarna uppstår under DNA-replikationen och repetitionerna kan bli både fler och färre. Flertalet faktorer har betydelse för frekvensen och typen av mutationer bland repetitionerna, tex det ursprungliga antalet repetitioner i ett locus eller längden av en enskild repetition. Kunskapen kring med vilken hastighet olika förändringar sker i olika repeterade sekvenser är ännu inte fullständig och behöver kartläggas ytterligare för att säkrare bedömningar rörande släktskap ska kunna utföras.

REFERENSER

• 1. Versalovic J, Lupski JR. Molecular detection and genotyping of pathogens: more accurate and rapid answers (Review). Trends in microbiology 2002;10(10):S15-S21.

• 2. Persing D, Smith T, Tenover F, White T. Diagnostic molecular microbiology principles and applications. American Society for Microbiology Washingtong D.C. 1993