Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA)
Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Molekylärbiologisk diagnostik
Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA)[redigera]
NASBA är en av amplifieringsmetoderna som är baserade på transkription (figur 17). Andra transkriptionsbaserade amplifieringssystem är bland annat Transcription Mediated Amplification (TMA), Transcription-based amplification system (TAS) och Self-sustained sequence replication (3SR). Kommersiella metoder baserade på denna process används för detektion av Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae och Mycobacterium tuberculosis Gen-probe samt för detektion av onkoprotein E6/E7 mRNA-uttryck från högrisk HPV Norchip. Templatet är vanligtvis RNA och metoden baseras på kopiering av RNA-målsekvensen med hjälp av tre olika enzymer; reverse transkriptas, RNaseH och T7 DNA-beroende RNA-polymeras. Metoden är isotermal, mycket snabb och ger mycket stora kopietal av målsekvensen. Mål-RNA kopieras först med enzymet reverse transkriptas till en DNA-molekyl som då bildar en RNA:DNA-hybrid. Enzymet RNaseH bryter ned RNA i denna hybrid som då innehåller endast cDNA. Många RNA-kopior kan då produceras, transkriberas, av enzymet T7 DNA-beroende RNA-polymeras från detta cDNA. Målsekvensen detekteras med en probe inmärkt med en fluorofor och en släckare/quencher, en molecular beacon probe (se Realtids-PCR). Ökningen av fluorescens i provet detekteras i en fluorescensläsare och analyseras. Risken för kontamination är mindre med system baserade på RNA-kopiering än DNA-kopiering, då RNA kopiorna som produceras inte är lika stabila som amplifierat DNA.
Figur 17. NASBA reaktionen. Bild; Technology Real Time NASBA, Copyright NorChip, [1]
