Skillnad mellan versioner av "Bilagor till VRE-diagnostiken"
| Rad 51: | Rad 51: | ||
====PCR-metod för påvisande av van-gener==== | ====PCR-metod för påvisande av van-gener==== | ||
| − | + | *'''''
vanA'' och ''vanB'' PCR för LightCycler (FRET-hybridiseringsprobe)''' | |
| + | |||
| + | Reaktionsvolymen är 20 μL varav 5 μl är templat. PCR mixen innehåller 1xHYB- master (Roche Diagnostics), 2 mM MgCl2, 1 μM av varje primer och 0.2 μM av varje hybridiserings-probe. | ||
| + | |||
| + | |||
| + | |||
| + | Primers
vanA-F 5 ́-TCGGCAAGACAATATGACAG-3 ́ vanA-R 5 ́-GTACAATGCGGCCGTTA-3 ́ vanB-F 5 ́-GAGGATGGTGCGATACA-3 ́ vanB-R 5 ́-GATGGATGCGGAAGATA-3 ́Prober
vanA-FL 5 ́-ACGCAGTTATAACCGTTCCCG -FL-3 ́
vanA-705 5 ́-LC705-AGACCTTTCAGCAGAGGAGCG-PH-3 ́ vanB-FL 5 ́-CCTGTCTTTGTGAAGCCG-FL-3 ́
vanB-640 5 ́-LC640-CACGGTCAGGTTCGTCCTTTGGCGT-PH-3 ́Storlek på PCR-fragmentet för vanA är 322 baspar och för vanB 423 baspar.Temperaturprofil LightCycler
Enzymaktivering: 95 oC 10 min. Slope 20 oC/s. 1 cykel.
Amplifiering: 95 oC 15 sek, 50 oC 15 sek, 72 oC 25 sek. 40 cykler. Slope 20 oC/s. Kylning: 40 oC 60 sek. Slope 20 oC/s.
Avläsning med color compensation. VanA och vanB avläses i olika kanaler. Smältpunktanalys behövs inte.VanA och vanB PCR för Rotor-Gene (TaqMan probe)Reaktionsvolymen är 20 μL varav 2 μl är templat. PCR mixen innehåller 1x perfeCta qPCR FastMix (Quanta bioscience), 0,2 μM av varje primer, 0,075 μM av varje Taqman-probe.Primers
vanA-F 5 ́-CGGCAAGACAATATGACAGCAA-3 ́ vanA-R 5 ́-TCAGTACAATGCGGCCGTTA-3 ́ vanB-F 5 ́-GGGAGGATGGTGCGATACA-3 ́ vanB-R 5 ́-CCGAAA TCGCTTGCTCAA-3 ́Prober vanA 5 ́HEX-CAGTTATAACCGTTCCCGCAGACCTT-BHQ1-3 ́ vanB 5 ́6FAM-CTTTGTGAAGCCGGCACGGTCAGGTT-BBQ-3 ́ Storlek på PCR-fragmentet för vanA är 322 baspar och för vanB 329 baspar.61Temperaturprofil för Rotor-Gene
Enzymaktivering: 95 oC i 3 min
Amplifiering: 95 oC i 3 sek, 60 oC i 20 sek. 40 cykler.
VanA och vanB avläses i olika kanaler. Smältpunktanalys behövs inte.PCR-metod för molekylärbiologisk verifiering av E. faecalis och E. faecium DdlE PCR för LightCyclerReaktionsvolymen är 20 μL varav 4 μl är templat. PCR mixen innehåller 1x LC- master, 4 mM MgCl2, 0,5 μM av varje primer och 0,04 units/μL FastStart Taq DNA-polymeras.LC-master innehåller 2x FastStart PCR-buffert (Roche diagnostics), 4 % DMSO (Sigma), 0,4 mM dNTP (Roche diagnostics), 0,2 mg/mL BSA (Roche diagnostics) och 1,2x SybrGreen I (Molecular Probes).Primer
EFS-F 5 ́-CACCTGAAGAAACAGGC-3 ́ EFS-R 5 ́-ATGGCTACTTCAATTTCACG-3 ́EFM-F 5 ́-AATAATAAAATCGAAATGCAGATTCC-3 ́ EFM-R 5 ́-TCCAGCCTCTTCTTTATTTCTCTTTAT-3 ́Storleken på DNA-fragmentet för E. faecalis är 475 baspar och för E. faecium 335 baspar.Temperaturprofil LightCycler
Enzymaktivering: 95 oC 10 min. Slope 20 oC/s. 1 cykel.
Amplifiering: 95 oC 15 sek, 54 oC 10 sek, 72 oC 25 sek. 35 cykler. Slope 20 oC/s. Smältpunktsanalys: 60–90 oC. Slope 0,1 oC/s
Kylning: 40 oC 30 sek. Slope 20 oC/s.Avläsning: Metoden är en cybergreen metod och läses av i våglängd 530 nm. Positiva prov ska uppvisa en amplifieringskurva samt att produkten ska ha en smälttopp runt 84–85 oC.62 | ||
Versionen från 26 februari 2012 kl. 11.20
Artikel publicerad februari 2012. Texten är preliminär ännu ej godkänd genom konsensusförfarande
Till huvudartikeln Vankomycinresistenta enterokocker (VRE), referensmetodik
Bilagor till VRE-diagnostiken
Bilaga 1
Diagnostiska minimikriterier för artdiagnostik av enterokocker (referensmetodik)
- Enterococcus spp: Minimikriterier: Typisk kolonimorfologi, grampositiv , katalasnegativ, galla-eskulin-positiv, alternativt positiv i agglutinationstest för grupp D, PYR-positiv . Andra egenskaper: Gråvita kolonier på blodagar, kan ha ingen hemolys, alfa- eller betahemolys, oftast gula kolonier på CLED-agar. Växer i buljong med 6,5 % NaCl (Tabell 4)
Bilaga 2
Anrikningsmedium för VRE-screening
- Galla-eskulinbuljong (Referenssubstrat):
- Typexempel Bile Esculin Azide Broth (Biolife) 42.7 g/L
- Innehåll------ Gram/L
- Trypton -------17
- Pepton --------3
- Jästextrakt------ 5
- Oxgalla-------- 10
- Natriumklorid------ 5
- Natriumcitrat------ 1
- Eskulin---------- 1
- Fe-ammonium-citrat------ 0,5
- Natriumazid-------0,25
- pH 7.1± 0.2
Galla-eskulinbuljong tillreds enligt tillverkarens anvisningar. Tillsätt vankomycin 4 mg/L och aztreonam 60 mg/L.
- Alternativ anrikningsbuljong (Todd-Hewittbuljong)
- Typexempel:T-H-buljong (BD)
- Innehåll --------Gram/L
- Infusion av kött------ 3,1
- Neopepton------20,0
- Dextros------ 2,0
- Natriumklorid------ 2,0
- Dinatriumfosfat------ 0,4
- Natriumkarbonat------ 2,5
- pH 7,8± 0.2
Todd-Hewittbuljong tillreds enligt tillverkarens anvisningar. Tillsätt vankomycin 4 mg/L och aztreonam 60 mg/L.
Bilaga 3
PCR-metod för påvisande av van-gener
- vanA och vanB PCR för LightCycler (FRET-hybridiseringsprobe)
Reaktionsvolymen är 20 μL varav 5 μl är templat. PCR mixen innehåller 1xHYB- master (Roche Diagnostics), 2 mM MgCl2, 1 μM av varje primer och 0.2 μM av varje hybridiserings-probe.
Primers vanA-F 5 ́-TCGGCAAGACAATATGACAG-3 ́ vanA-R 5 ́-GTACAATGCGGCCGTTA-3 ́ vanB-F 5 ́-GAGGATGGTGCGATACA-3 ́ vanB-R 5 ́-GATGGATGCGGAAGATA-3 ́Prober vanA-FL 5 ́-ACGCAGTTATAACCGTTCCCG -FL-3 ́ vanA-705 5 ́-LC705-AGACCTTTCAGCAGAGGAGCG-PH-3 ́ vanB-FL 5 ́-CCTGTCTTTGTGAAGCCG-FL-3 ́ vanB-640 5 ́-LC640-CACGGTCAGGTTCGTCCTTTGGCGT-PH-3 ́Storlek på PCR-fragmentet för vanA är 322 baspar och för vanB 423 baspar.Temperaturprofil LightCycler Enzymaktivering: 95 oC 10 min. Slope 20 oC/s. 1 cykel. Amplifiering: 95 oC 15 sek, 50 oC 15 sek, 72 oC 25 sek. 40 cykler. Slope 20 oC/s. Kylning: 40 oC 60 sek. Slope 20 oC/s. Avläsning med color compensation. VanA och vanB avläses i olika kanaler. Smältpunktanalys behövs inte.VanA och vanB PCR för Rotor-Gene (TaqMan probe)Reaktionsvolymen är 20 μL varav 2 μl är templat. PCR mixen innehåller 1x perfeCta qPCR FastMix (Quanta bioscience), 0,2 μM av varje primer, 0,075 μM av varje Taqman-probe.Primers vanA-F 5 ́-CGGCAAGACAATATGACAGCAA-3 ́ vanA-R 5 ́-TCAGTACAATGCGGCCGTTA-3 ́ vanB-F 5 ́-GGGAGGATGGTGCGATACA-3 ́ vanB-R 5 ́-CCGAAA TCGCTTGCTCAA-3 ́Prober vanA 5 ́HEX-CAGTTATAACCGTTCCCGCAGACCTT-BHQ1-3 ́ vanB 5 ́6FAM-CTTTGTGAAGCCGGCACGGTCAGGTT-BBQ-3 ́ Storlek på PCR-fragmentet för vanA är 322 baspar och för vanB 329 baspar.61Temperaturprofil för Rotor-Gene Enzymaktivering: 95 oC i 3 min Amplifiering: 95 oC i 3 sek, 60 oC i 20 sek. 40 cykler. VanA och vanB avläses i olika kanaler. Smältpunktanalys behövs inte.PCR-metod för molekylärbiologisk verifiering av E. faecalis och E. faecium DdlE PCR för LightCyclerReaktionsvolymen är 20 μL varav 4 μl är templat. PCR mixen innehåller 1x LC- master, 4 mM MgCl2, 0,5 μM av varje primer och 0,04 units/μL FastStart Taq DNA-polymeras.LC-master innehåller 2x FastStart PCR-buffert (Roche diagnostics), 4 % DMSO (Sigma), 0,4 mM dNTP (Roche diagnostics), 0,2 mg/mL BSA (Roche diagnostics) och 1,2x SybrGreen I (Molecular Probes).Primer EFS-F 5 ́-CACCTGAAGAAACAGGC-3 ́ EFS-R 5 ́-ATGGCTACTTCAATTTCACG-3 ́EFM-F 5 ́-AATAATAAAATCGAAATGCAGATTCC-3 ́ EFM-R 5 ́-TCCAGCCTCTTCTTTATTTCTCTTTAT-3 ́Storleken på DNA-fragmentet för E. faecalis är 475 baspar och för E. faecium 335 baspar.Temperaturprofil LightCycler Enzymaktivering: 95 oC 10 min. Slope 20 oC/s. 1 cykel. Amplifiering: 95 oC 15 sek, 54 oC 10 sek, 72 oC 25 sek. 35 cykler. Slope 20 oC/s. Smältpunktsanalys: 60–90 oC. Slope 0,1 oC/s Kylning: 40 oC 30 sek. Slope 20 oC/s.Avläsning: Metoden är en cybergreen metod och läses av i våglängd 530 nm. Positiva prov ska uppvisa en amplifieringskurva samt att produkten ska ha en smälttopp runt 84–85 oC.62