Vankomycinresistenta enterokocker (VRE), referensmetodik

Hoppa till: navigering, sök

Till Socialstyrelsens falldefinition Vancomycinresistenta enterokocker (VRE)


Artikel publicerad februari 2012. Texten Àr preliminÀr, Ànnu ej beslutad genom konsensusförfarande


Vankomycinresistenta enterokocker (VRE), referensmetodik

PĂ„visande av enterokocker i mikrobiologisk rutindiagnostik

PrimÀr diagnostik av VRE förutsÀtter fenotypisk artdiagnostik av Enterococcus faecalis och Enterococcus faecium, och att man sÀkert kan skilja dessa arter frÄn övriga enterokocker och frÄn andra naturligt vankomycinresistenta grampositiva bakterier som Lactobacillus, Leuconostoc och Pediococcus spp.

Diagnostiska minimikriterier för primÀr artdiagnostik av enterokocker, se bilaga 1.

Observera att enterokocker Àr positiva i agglutinationstest för Lancefields grupp-D-antigen (observera att Àven grupp-D-streptokocker Àr positiva i galla-eskulin, men negativa i PYR).

I bilaga 1 anges att för att skilja olika enterokockarterna frÄn varandra anvÀnds jÀsning av arabinos (E. faecalis Àr negativ medan övriga enterokocker Àr positiva) alternativt tellurit (E. faecalis Àr positiv och E. faecium Àr negativ), rörlighet (bÄde E. faecalis och E. faecium Àr orörliga) samt kÀnslighet för penicillin och cefadroxil. E. faecalis och E. faecium har högre grad av resistens mot dessa betalaktamer Àn E. casseliflavus och E. gallinarum. De tvÄ sistnÀmnda arterna isoleras dock sÀllan frÄn kliniska prover, men de utgör ett problem i samband med screening av feces- eller perianalprover pÄ förekomst av glykopeptidresistenta enterokocker.Om man anvÀnder screeningmetoder med medier som innehÄller selekterande och differentierande substanser, inklusive vankomycin, medför det att Àven andra bakterier (Lactobacillus, Leuconostoc och Pediococcus spp)) som alltid Àr resistenta mot vankomycin och/eller teikoplanin fastnar i screenodlingen. Genom att först göra gramfÀrgning och PYR-test kan icke relevanta arter sorteras bort.

PÄvisning av enterokocker med nedsatt kÀnslighet för vankomycin

Referensgruppen för antibiotikafrĂ„gor – metodgruppen (RAF-M, frĂ„n 2011 Nordicast rekommenderar lappdiffusionsmetoden för att upptĂ€cka vankomycinresistens (för zonbrytpunkter och detaljerad metod se www.srga.org.). Vid minskad hĂ€mningszon och/eller oskarp zonkant med gradvis avtagande vĂ€xt runt vankomycinlappen ska isolatet karakteriseras vidare genom molekylĂ€rbiologisk pĂ„visning av resistensgen (se nedan).

Lappdiffusionsmetoden Àr beroende av korrekt inokulat samt av att avlÀsaren Àr uppmÀrksam pÄ zonkantens kvalitet. Om förhÄllandena inte Àr optimala kan enstaka VRE-isolat missas i denna test varför kvalitetssÀkring av diagnostiken genom att delta i externa kvalitetskontrollprogram Àr av stor vikt.

Art- och resistensbestÀmning med automatiserade system

För art- och resistensbestÀmning Àr automatiserade system, som exempelvis Vitek 2 (bioMerieux) och Phoenix 100 (Becton Dickinson), enligt litteraturen vÀl anpassade för att upptÀcka vankomycinresistens. Vissa problem finns dock rapporterade vad gÀller artidentifiering av Enterococcus spp (2, 3, 4) och fyndet bör dÀrför verifieras med referensmetod enligt ovan. Liksom vid manuell metodik ska Àven isolat som pÄvisas med automatiserade system verifieras med genetiskt pÄvisande av resistensgen.

Verifiering av VRE med molekylÀrbiologisk metod (PCR)

Isolat som har identifierats som VRE med fenotypiska metoder bör verifieras med molekylÀrbiologisk metod, PCR (Polymerase chain reaction), dÀr ligas-generna som medierar vankomycinresistens (i första hand vanA och vanB) pÄvisas. Flera metoder för detta med konventionell PCR eller realtids-PCR, har publicerats och Àr kommersiellt tillgÀngliga.

Metod för genetisk verifiering av art kan utföras med PCR för artspecifika ligas- gener (ddl-E. faecium/faecalis/casseliflavus/gallinarum). För referenser samt beskrivning av en PCR-metod för att verifiera VRE, se bilaga 3.

Sammanfattning av avsnitt 1

  • För korrekt detektion av VRE bör enterokocker artbestĂ€mmas och samtliga relevanta fynd resistensbestĂ€mmas med lappdiffusionstest för vankomycin.
  • Vid lappdiffusionsmetod Ă€r inokulatets tjocklek samt zonkantens karaktĂ€r av största vikt.
  • Vid minskad hĂ€mningszon och/eller oskarp zonkant med gradvis avtagande vĂ€xt runt vankomycinlappen ska isolatet karakteriseras vidare genom genetisk pĂ„visning av resistensgen. ‹

Metod för screening inklusive genetisk verifiering av VRE

Detta avsnitt beskriver metod för screening och genetisk verifiering av generna vanA och vanB hos E. faecalis och E. faecium. Metoden bestÄr av anrikning av provet över natt i en selektiv buljong med vankomycin, följt av analys av buljongen med hjÀlp av realtids-PCR för att detektera resistensgenerna vanA och vanB. Med denna metod kan negativa prov besvaras relativt snabbt. Prov som Àr positiva i PCR-analysen mÄste odlas ut för att möjliggöra identifiering av enterokockerna.

Anrikning i selektiv buljong

Vid screening av VRE bör provet anrikas i selektiv buljong eftersom det ger bĂ€ttre utbyte Ă€n vid direkt odling pĂ„ selektiv agarplatta (5). Basen kan utgöras av Todd- Hewitt-buljong eller Galla-eskulin-buljong (6). För selektionen tillsĂ€tts vankomycin 4 mg/L och aztreonam 60 mg/L (protokoll, se bilaga 2). Koncentrationen av vankomycin bör vara 4 mg/L eftersom ocksĂ„ lĂ„ggradig resistens kan orsakas av vanB-genen. För vildtypspopulationen av E. faecium och E. faecalis dominerar MIC-vĂ€rden 0,5–4 mg/L, medan MIC-vĂ€rdena kan variera 4–1024 mg/L om bakterien har vanB-genen (EUCAST).

Vid provsĂ€ttningen bryts provtagningspinnen ned i buljongen varefter buljongerna inkuberas i skakinkubator 35°C 16–24 h. Efter inkubation analyseras alla buljonger. Enterokocker bör ge ett svart fĂ€rgomslag i Galla-eskulinbuljongen, men Ă€ven ljusa buljonger kan innehĂ„lla stora mĂ€ngder VRE. Detektionen för vanA- och vanB-generna sker med hjĂ€lp av PCR direkt pĂ„ buljongen eller pĂ„ bakteriekolonier efter utodling pĂ„ selektivt substrat.

Detektion med realtids-PCR för vanA och vanB

‹Extraktion av DNA frĂ„n buljongkulturerna utförs bĂ€st i nĂ„got av de automatiserade system som finns pĂ„ marknaden.PCR-metoden som beskrivs i bilaga 3 Ă€r en modifierad duplex in-house-PCR (8) som har utvecklats vid Klinisk Mikrobiologi i Halmstad. Den Ă€r utvĂ€rderad för FRET-hybridiseringsprober i LightCycler (Roche) och TaqMan-prober i Rotor- Gene 6000. Sekvenserna för vanA och vanB ligger i konserverade regioner och detekterar varianterna vanB1, vanB2 och vanB3 (7,8,9) (primers, prober och temperaturprofil, se bilaga 3). Alternativa egenutvecklade eller kommersiella metoder för att genetiskt verifiera vanA och vanB med validerade prestanda kan ersĂ€tta den hĂ€r beskrivna PCR-metoden.

Vid positivt PCR-resultat odlas buljongen ut, och misstÀnkta enterokocker verifieras med art- och resistensbestÀmning enligt ovan. Observera att van-generna kan förekomma Àven hos bakterier i den normala tarmfloran som exempelvis hos klostridier. Alla positiva PCR-fynd mÄste dÀrför verifieras.

Detektion med utodling

Anrikningsbuljongerna kan odlas ut pÄ selektivt kromogent substrat med vankomycin, alternativt icke-selektivt medium med vankomycinlapp (7).

Plattorna inkuberas i 24 h för att ge lÀmplig kolonistorlek att arbeta vidare med. MisstÀnkta kolonier verifieras med fenotypiska metoder för art- och resistensbestÀmning, och van-gen verifieras med PCR.

ArtbestÀmning av VRE med PCR för ddlE.

Som komplement till artbestÀmningen med biokemiska metoder kan en PCR för artspecifika ligas-gener (ddlE) anvÀndas. PCR-metoden skiljer pÄ E. faecalis och E. faecium. Kommersiella eller egenutvecklade metoder kan anvÀndas för detta. I litteraturen beskrivs metoder för detta som block-PCR med detektion pÄ gel (5). Samma protokoll har Àven utvecklats för realtidsplattform, se bilaga 3.

Sammanfattning av avsnitt 3

  • Anrikning bör för acceptabel kĂ€nslighet ske i selektiv buljong. Koncentrationen av vankomycin bör vara 4 mg/L.
  • För att fĂ„ snabbt utsvar av negativa prov bör buljongerna analyseras med realtids-PCR för vanA och vanB. MisstĂ€nkta enterokocker mĂ„ste artbestĂ€mmas och resistensbestĂ€mmas samt genomgĂ„ genetisk verifiering av van-typ. ‹

Epidemiologiska typningsmetoder för VRE

‹Epidemiologisk typning av bakterier anvĂ€nds i första hand för att jĂ€mföra bakterieisolat dĂ„ misstanke om smittspridning finns. För att identifiera en sannolik smittkedja krĂ€vs i första hand ett epidemiologiskt samband i tid och rum mellan patienter/personer, och dessutom ett samband mellan olika isolat som visats genom överensstĂ€mmande typningsresultat. ‹Rekommenderad metodik för epidemiologisk typning av enterokocker, liksom för de flesta bakteriearter Ă€r pulsfĂ€ltsgelelektrofores (PFGE), en metod som baserar sig pĂ„ klyvning av bakteriens DNA med restriktionsenzymer följt av separation av 17 DNA-fragment i en agarosgel, och analys av bandmönster (Figur 1). För varje bakterieart mĂ„ste testbetingelserna optimeras, bĂ„de i val av restriktionsenzym och i övriga förhĂ„llanden i testsystemet. I den mĂ„n det finns internationellt accepterade metoder Ă€r det fördelaktigt att följa dessa, men sĂ„dana finns tyvĂ€rr endast för ett fĂ„tal bakteriearter som till exempel Staphylococcus aureus, sĂ€rskilt meticillinresistenta S. aureus (MRSA).

Internationellt accepterade kriterier för att bedöma samband mellan isolat kan ofta anvÀndas vid analys av isolatens bandmönster, men frÄgestÀllningen i det enskilda fallet, samt erfarenhet av den lokala eller nationella situationen, mÄste ocksÄ vÀgas in vid bedömning. En av nackdelarna med PFGE Àr att resultaten inte Àr numeriska och dÀrmed inte enkelt kommunicerbara mellan laboratorier. Trots detta har PFGE anvÀnts och anvÀnds som en av de mest diskriminerande typningsmetoderna för MRSA, PNSP och för bakterier som tillhör familjen Enterobacteriaceae och metoden Àr sÄledes vÀl etablerad. Den kommer under överskÄdlig tid att finnas tillgÀnglig vid referenslaboratorium för att analysera misstÀnkta anhopningar av bakterieisolat och för nationell övervakning.

Det finns alternativa DNA-baserade typningsmetoder för enterokocker som till exempel MLST (Multi Locus Sequence Typing) och MLVA (Multi Locus Variable Number of Tandem Repeats Analysis). MLST baseras pĂ„ sekvensering av sju ”house-keeping genes” vilket gör den dyrbar och mindre snabb, men fördelen med metoden Ă€r att resultatet lĂ€tt kan kommuniceras i form av sekvenstyper (ST). Den Ă€r, liksom för andra bakteriearter, mindre diskriminerande Ă€n PFGE och lĂ€mpar sig dĂ€rför bĂ€ttre för globala fylogenetiska studier. MLVA Ă€r ocksĂ„ en sekvensbaserad metod och snabbare Ă€n MLST. Den har Ă€nnu inte prövats i tillrĂ€cklig omfattning för att man ska kunna rekommendera den som alternativ till PFGE.

Det finns i nulÀget (Är 2012) ingen konsensus internationellt om vilken metod som Àr mest lÀmpad för epidemiologisk typning av VRE, varken för E. faecalis eller för E. faecium. Det vore önskvÀrt med en sekvensbaserad metod (liknande spa-typning för MRSA) som Àr överlÀgsen i snabbhet och som ger resultat som enkelt kan kommuniceras till omvÀrlden.

Fram till 2006 anmĂ€ldes till SMI i genomsnitt 26 nya fall per Ă„r frĂ„n hela landet. Under andra halvĂ„ret 2007 ökade antalet anmĂ€lda VRE-fall signifikant. Även 2008 ökade antalet anmĂ€lda fall kraftigt, men följdes av fĂ€rre antal anmĂ€lningar under 2009 och 2010. Smittskyddsinstitutet anser att det Ă€r viktigt att Sverige kan behĂ„lla sin i internationell jĂ€mförelse relativt gynnsamma situation avseende VRE. DĂ€rför bör en samlad nationell kunskap om genetisk likhet mellan identifierade isolat som pĂ„visar aktuell smittspridning prioriteras. Detta för att skapa underlag till sĂ„vĂ€l riktade preventiva insatser som till utvĂ€rdering av insatserna.

Sammanfattning av avsnitt 5

Epidemiologisk typning har i huvudsak tre syften;

  • vid utredning och kontroll av VRE-utbrott pĂ„ lokal nivĂ„
  • för nationell samording av kunskapen om utbrotten för att fĂ„ en överblick över epidemiologin
  • vid utvĂ€rdering av preventiva insatser
  • typning av VRE utförs i dagslĂ€get huvudsakligen med PFGE.
  • MisstĂ€nkta klonala utbrott bör verifieras med PFGE.
  • för nationell överblick av pĂ„gĂ„ende VRE-spridning inom landet bör isolat frĂ„n samtliga nyupptĂ€ckta fall skickas till Smittskyddsinstitutet för epidemiologisk typning. Återkoppling till insĂ€ndande laboratorium och till ansvarig smittskyddsenhet bör ske inom 14 dagar.


PFGE-VRE.jpg

Bilagor till VRE-diagnostiken

REFERENSER

  • 1. Föreningen för Medicinsk Mikrobiologi vid Svenska LĂ€karesĂ€llskapet och Smittskyddsinstitutet. Referensmetodik för laboratoriediagnostik vid kliniskt mikrobiologiska laboratorier utgiven. Artikel Enterokocker och streptokocker-minimikriterier vid speciesbestĂ€mning
  • 2. Pendle S, Jelfs T, Olma T, Su Y, Gilroy N, Gilbert GL. Difficulties in detection and identification of Enterococcus faecium with low-level inducible resistance to vancomycin, during a hospital outbreak. Clinical Microbiology and Infection. 2008 Sep; 14(9):853-7.
  • 3. Snyder JW, Munier G, Johnson C. Direct Comparison of the BD PhoenixTM Automated Microbiology System with the Microscan Walkaway for Identification and Antimicrobial Susceptibility Testing of Staphylococci, Enterococci and Antimicrobial Susceptibility of Streptococci. Presented at the 106th General Meeting of the American Society for Microbiology (ASM), Orlando, FL, 2006.
  • 4. Kobayashi I, Muraoka H, Iyoda T, Nishida M, Hasegawa M. Yamaguchi K. Antimicrobial susceptibility testing of vancomycin-resistant Enterococcus by the VITEK 2 system, and comparison with two NCCLS reference methods. J Med Microbiol. 2004 Dec; 53 (Pt 12):1229-32.
  • 5. Ieven M, Vercauteren E, Descheemaeker P, van Laer F, Goossens H. Comparison of direct plating and broth enrichment culture for the detection of intestinal colonization by glycopeptide- resistant enterococci among hospitalized patients. J Clin Microbiol. 1999 May; 37(5): 1436-40.
  • 6. Isenberg HD, Goldberg D, Sampson J. Laboratory studies with a selective Enterococcus medium. Appl Microbiol. 1970 Sep; 20(3): 433-6.
  • 7. Palladino S, Kay ID, Costa AM, Lambert E J, Flexman JP. Real-time PCR for the rapid detection of vanA and vanB genes. Diagn Microbiol Infect Dis. 2003 Jan; 45(1):81-4.
  • 8. Dahl KH, Simonsen GS, OlsvikO, Sundsfjord, A. Heterogeneity in the vanB gene cluster of genomically diverse clinical strains of vancomycin-resistant enterococci. Antimicrob Agents Chemother. 1999 May; 43(5):1105-10.
  • 9. Depardieu F, Perichon B, Courvalin P. (2004). Detection of the van alphabet and identification of enterococci and staphylococci at the species level by multiplex PCR. J Clin Microbiol. 2004 Dec; 42(12): 5857-5860.