Kromogena substrat

Hoppa till: navigering, sök

Artikel publicerad december 2011. Texten Àr preliminÀr, Ànnu ej beslutad genom konsensusförfarande


Till artikeln Översikt fasta substrat för bakteriologiska odlingar


Kromogena substrat

Introduktion

Kommersiella kromogena fasta substrat för mikrobiologisk odlingsdiagnostik har funnits pĂ„ marknaden i drygt 20 Ă„r och anvĂ€nds i ökande omfattning pĂ„ landets laboratorier. De saluförs bĂ„de som fĂ€rdiga plattor eller som dehydrerade medier för egen tillverkning. För diagnostik av jĂ€stsvampar rekommenderas kromagar som ett av referenssubstraten. För övrigt kan de i flera fall vara anvĂ€ndbara alternativ eller komplement till referenssubstraten. Det Ă€r dĂ„ viktigt att kĂ€nna till de kromogena substratens fördelar och begrĂ€nsningar jĂ€mfört med referenssubstraten. Eftersom kromogena substrat visualiserar mĂ„lorganismer i olika distinkta kolonifĂ€rger kan man lĂ€ttare urskilja dessa i blandfloror Ă€n med gĂ€ngse medier. Med vana avlĂ€sare kan detta innebĂ€ra högre diagnostisk kĂ€nslighet. Även om det inte gĂ€ller generellt, kan slutlig diagnos ofta direkt stĂ€llas med rimligt hög specificitet utan ytterligare testning av organismerna, vilket kan innebĂ€ra sĂ„vĂ€l tidsmĂ€ssiga som ekonomiska vinster trots att substraten generellt Ă€r dyrare Ă€n standardsubstraten.


Kromogener Àr substanser som dÄ de hydrolyseras av speciesspecifika mikrobiella enzymer frisÀtter en fÀrgad, oftast atoxisk, produkt (Perry, J.D., FreydiÚre, 2007). Denna Àr bunden till de enskilda kolonierna och diffunderar inte ut i det kringliggande mediet, vilket gör de kromogena substraten sÀrskilt lÀmpade att skilja mÄlorganismerna frÄn övrig flora. Som kromogener anvÀnds vanligen olika halogenderivat av indoxyl (exempelvis 5-bromo-4 kloro indoxyl) som i substratet kopplats till olika glykosider (exempelvis galaktosid eller glukuronid). Hydrolys av molekylerna via (species)specifika mikrobiella enzymer (exempelvis glukuronidas hos E. coli) frisÀtter indoxyl som i nÀrvaro av syre ihopkopplas till dimerer. Beroende pÄ vilka halogener som kopplats till indoxyl uppstÄr dÄ olika, ofta intensiva fÀrger. För detektion av beta-glukosidasbildande mikrober (exempelvis enterokocker och Streptococcus agalactiae) anvÀnds ofta glykosiden eskulin som vid hydrolys bildar eskuletin vilket i sin tur tillsammans med jÀrn bildar ett svart/brunt komplex. Andra substanser, som fenoler och alisarin (det senare bestÄndsdel i fÀrgen krapplack), anvÀnds ocksÄ som kromogener i substrat. TyvÀrr anger fabrikanterna sÀllan den exakta (patentskyddade) kompositionen av den kromogena mixen.


Det bör observeras att fĂ€rgblindhet förekommer hos 8 % (mĂ€n) och 1 % (kvinnor). SĂ„dana individer kan ha svĂ„righeter att skilja kolonifĂ€rgerna pĂ„ de kromogena substraten (Odds, Bernaerts, 1994). Detta kan vara vĂ€rt att uppmĂ€rksamma pĂ„ laboratorierna i samband med placering av personal.

Substratkontroller

Inför upphandlingar av kromogena substrat, oavsett om de levereras som fÀrdiga plattor eller som dehydrerade medier ska, enligt principerna för substratattestningar, ett antal fabrikat prövas mot varandra och ocksÄ jÀmföras mot nÄgot av referenssubstraten (exempelvis CLED-agar nÀr det gÀller substrat för urindiagnostik). Det Àr lÀmpligt att jÀmföra growth index relativt referenssubstratet med viable count för ett antal nyckelorganismer. Viktigt Àr att bedöma allmÀnt koloniutseende och hur vÀl fÀrgerna överensstÀmmer med de av leverantören angivna. De fortlöpande tillverkningstesterna kan ske med de av fabrikanten rekommenderade organismerna. Se för övrigt om substratkontroll i artiklarna Bilaga 2:Substratkontroll- Hud, mjukdelar, skelett och inre organ, 4. Substratkontroll-svamp, KvalitetssÀkring-diagnostik mage, tarm, Bilaga 1b. Substratkontroll, Urin-bilaga 1, Bilaga 1 Bakteriologiska substratrecept-NLI.

AnvÀndningsomrÄden för kromogena substrat inom klinisk mikrobiologi

Urinodlingar

BakterievÀxt pÄ Kromagar avsedd för urin jÀmfört med CLED-agar. Foto Camilla Svensson

Ett antal fasta kromogena substrat marknadsförs som alternativ till gĂ€ngse odlingssubstrat (CLED-, blod-, McConkey-agar). Kombinationen blodagar och kromogena substrat torde ge likvĂ€rdiga diagnostiska prestanda som kombinationen blod- och CLED-agar (Kvantitativ urinodling-hög rutinnivĂ„ (NivĂ„ 2)). De kromogena substaten medger direkt presumtiv identifiering av E. coli, Klebsiella/Enterobacter/Serratia, Proteus/Morganella/Providencia och enterokocker. Med vissa fabrikat kan ocksĂ„ S. saprophyticus identifieras presumtivt. Övriga grampositiva bakterier vĂ€xer ofta sĂ€mre och ungefĂ€r som pĂ„ CLED-agar. Specificiteten för identifiering av E. coli, P. mirabilis och enterokocker Ă€r allmĂ€nt hög oavsett fabrikat.


För alla fabrikat av kromogena medier rekommenderas inkubering aerobt, 35-37 °C.


I en studie publicerad 2002 (Aspevall et al) jĂ€mfördes referenssubstraten CLED, blod-agar och McConkey-agar, mot fyra kommersiella kromogena substrat (Chromagar Orientation frĂ„n BBL, CHROMagar Orientation, CHROMagar, Chromogenic UTI Medium, Oxoid, och CPS ID, bioMĂ©rieux). Studien omfattade 1200 urinprov med totalt 420 kliniskt relevanta bakteriella isolat som bedömdes som kliniskt relevanta. VĂ€xten pĂ„ de kromogena substraten var i nivĂ„ med referenssubstraten sĂ„vĂ€l kvantitativt som kvalitativt; efter ett dygn vĂ€xte 99-100 % av isolaten pĂ„ referenssubstraten mot 97-99 % pĂ„ de kromogena. Efter 2 dygns inkubering var skillnaderna i vĂ€xt i huvudsak kvar. I studien konstaterades att nĂ„gra av enterokockisolaten i blandkulturer bara kunde identifieras pĂ„ de kromogena substraten och att antalet jĂ€stisoleringar blev fĂ€rre med dessa substrat. JĂ€mfört med standarddiagnostiska metoder identifierades E. coli korrekt i 95-99 % av fallen pĂ„ de kromogena substraten, men ett av 5 Citrobacter species identifierades som E. coli. Författarna konkluderade att kromogena substrat kan anvĂ€ndas som ensamt alternativ till CLED-agar (Kvantitativ urinodling-lĂ„g rutinnivĂ„ (screening, NivĂ„ 1)) för isolering av uropatogener.

I en studie av Whittier och Della-Latta (2005) jĂ€mfördes resultat av odling av 785 urinprov pĂ„ ett biplattsystem (blod/MacConkey) mot odling pĂ„ Chromagar Orientation (BBL). Identiska positiva odlingsresultat erhölls i 355 prov, medan olika resultat erhölls i 21 fall (2,7 %). I endast sex av dessa bedömdes skillnaderna ha klinisk betydelse (blandfloror dĂ€r man endast med kromagarn identifierade vĂ€xt av enterokocker). Mellan 43 och 44 % (materialet Ă„ldersstratifierat) av resultaten pĂ„ kromagar hade kunnat rapporteras direkt utan vidare testningar. Författarna konstaterade att nyttan med kromagar framförallt var att lĂ€ttare kunna identifiera mĂ„lbakterier i blandfloror och att direkt identifiering av vissa bakterier (frĂ€mst E. coli och enterokocker) kunde bidra till minskat behov av verifierande biokemiska tester.

I tabell 1 visas vÀxtsÀtt för sju olika referensstammar (bakterier och svamp) pÄ tre standardsubstrat och Chromagar Orientation agar (BBL). Som framgÄr av tabellen var den prövade loten av kromagarn i stort sett likvÀrdig med referenssubstratet (CLED-agar). Ett av jÀstsvampisolaten vÀxte bÀttre pÄ kromagar Àn CLED, men enterokockerna nÄgot sÀmre. I en annan in vitro-prövning utförd i VÀsterÄs (2009) jÀmfördes CPS ID (bioMÚrieux) mot CLED med 10 CCUG-stammar (presumtiva mÄlbakterier för urinvÀgsdiagnostiken) betrÀffande vÀxt (koloniantal, kolonistorlek, koloniutseende) och kolonifÀrg. E. faecalis vÀxte genomgÄende med nÀra dubbla koloniantalet pÄ det kromogena substratet jÀmfört med CLED. Staphylococcus aureus och Streptococcus agalactiae vÀxte med mycket smÄ kolonier, övriga (E. coli, Klebsiella, Acinetobacter, Pseudomonas) med medelstora eller stora kolonier. FÀrgomslagen överensstÀmde genomgÄende med fabrikantens beskrivningar. Resultaten av dessa jÀmförelser illustrerar vikten av att vid upphandling jÀmföra olika fabrikat av kromagar mot varandra och ocksÄ mot referenssubstrat (CLED-agar).

BKromogentabell.jpg

Fecesodlingar

Salmonella: Flera kommersiella kromogena substrat finns tillgĂ€ngliga för presumtiv identifiering av Salmonella men Ă€nnu inga för Shigella. De Ă€r generellt mĂ„ttligt selektiva substrat (ungefĂ€r som McConkey-eller XLD-agar) ofta med ett kromogent substrat för beta-galaktosidas. PĂ„ sĂ„dana substrat vĂ€xer fecesflorans koliforma bakterier med blĂ„-gröna eller blĂ„-violetta kolonier medan Salmonella, som saknar beta-galaktosidas, vĂ€xer med röda kolonier (typsubstrat Rambach-agar; via jĂ€sning av propylenglykol). Andra kromogena Salmonella-substrat har glukuronsyra eller kromogent alfa-galaktosidas som indikator för mĂ„lbakterierna. Under senare tid har substrat som detekterar specifika Salmonella-esteraser (exempelvis kromogenent magenta-kaprylat) blivit vanligare. MĂ„lbakterierna blir med dessa substrat ljust lila, purpur-eller magentafĂ€rgade. Även S. Typhi och S. Parathypi kan presumtivt identifieras pĂ„ esterasbaserade medier.

Sensitivitet och specificitet hos de kromogena Salmonella-substraten tycks inte vara helt i paritet med referenssubstratens (XLD, DC). I en studie dĂ€r testmediet hade kromogen alfa-galaktos (Perry et al 2002) konstaterades att bara drygt hĂ€lften av Salmonella-isolaten producerade alfa-galaktosidas. I en annan studie (Perry et al 2003) jĂ€mfördes fyra kromogena Salmonella-substrat mot Hektoen-agar. KĂ€nsligheten efter anrikning av fecesproven varierade för de kromogena substraten mellan 85,9 och 93,8 % mot 98,4 % för Hektoen-agar. DĂ€remot var specificiteten hög (>91 % för alla kromogena substrat mot 78 % för Hektoen-agar). Författarna ansĂ„g att framförallt de i studien ingĂ„ende esteras-baserade medierna kunde rekommenderas för bruk i rutindiagnostik, eftersom dessa kunde minska behovet av differentierande biokemiska tester.

Nyttan av kromogent agarmedium för detektion av Salmonella i rutindiagnostiken Àr oklar. Referensmetodiken förutsÀtter att minimikriterier, baserade pÄ biokemiska tester, skall vara uppfyllda för anmÀlan. Rutindiagnostiken ocksÄ omfattar detektion av Shigella.

EHEC O157: Substrat för primÀrisolering av EHEC O157 bygger pÄ principerna att bakterierna inte jÀser sorbitol (SMAC-agar) eller att de saknar beta-glukuronidasaktivitet. Ett andra kromogent substrat (exempelvis för alfa-eller beta-galaktosidas) finns inkorporerade i vissa av fabrikaten. Visserligen har substraten generellt hög kÀnslighet och specificitet för presumtiv pÄvisning av O157-bakterier, men inte för detektion av övriga EHEC-serotyper (Murinda et al. 2004). Behovet av dessa substrat Àr dÀrför oklart.

Listeria monocytogenes: Kromogena substrat för identifiering av Listeria monocytogenes finns kommersiellt tillgÀngliga. Dessa Àr dock i princip avsedda för pÄvisande av bakterien i födoÀmnen och i miljön (Reissbrodt 2004). Anrikningsbuljong (selektiv PALCAM-buljong) kan anvÀndas för övernattanrikning av bakterien i fecesprov. SekundÀr spridning pÄ selektiva kromagarmedia (exempelvis BBL CHROMagar Listeria) kan dÀrefter göras. VÀrdet av förfarandet för diagnostik av gastroenteriter Àr oklar.

Vibrio

Kromogena substrat finns för selektiv isolering av olika kliniskt relevanta Vibrio-arter (V. cholerae/V. vulnificus, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus; CHROMagar Vibrio, BACTUS). Olika provmaterial kan anvÀndas, som pinnprov frÄn sÄr (Nakashima et al 2007). Substratens eventuella roll i diagnostiken Àr oklar.

Staphylococcus aureus

Kromagar för detektion av S. aureus har funnits pĂ„ marknaden i drygt 10 Ă„r. De har en kĂ€nslighet jĂ€mfört med standardsubstrat (blod-agar) pĂ„ drygt 95 %. Vissa fabrikat dĂ€r kromogenen baseras pĂ„ alfa-glukosidas har i studier uppvisat bĂ„de hög kĂ€nslighet (nĂ€ra 97 %; S. aureus ID) och specificitet (>90 %, Perry et al 2003). Detta substrat inhiberar ocksĂ„ effektivt enterokocker vilket kan vara en fördel i avlĂ€sningssituationen. Med inget av de kromogena substraten för S. aureus kan man avvara konfirmerande tester.

Svampodlingar

Ett antal kromogena substrat finns tillgÀngliga för detektion av jÀstsvamp i kliniska prover. De Àr i synnerhet lÀmpade för differentiering av olika svampar (blandfloror) i kliniska prov, vilket Àr huvudsyftet med att i referensmetodiken ange kromagar som ett av de primÀra referenssubstraten. Som kromogen anvÀnds substrat för beta-hexosamidas som möjliggör presumtiv identifiering av Candida albicans (gröna kolonier). C. dubliniensis kan med vissa fabrikat misstas för C. albicans, Àven om de ger mer mörkt gröna kolonier Àn C. albicans. De olika kromagarfabrikaten (exempelvis BBL CHROMagar Candida, licencierat av CHROMagar, Paris, Frankrike) innehÄller kromogener som substrat för artspecifika jÀstenzymer och tillÄter differentiering av C. albicans, C. glabrata, C. fragilis och C. krusei med hög specificitet. I en in vitro-studie (Eraso et al, 2006) jÀmfördes Candida ID 2 (bioMerieux, ett kromogent substrat i första hand för identifiering av C. albicans som framtrÀder med blÄa kolonier, men ocksÄ av blandfloror) mot CHROMagar Candida. Candida ID 2 kunde enligt författarna skilja C. albicans frÄn C. dubliniensis genom olika blÄ schattering av kolonierna. Vi rekommenderar att i fall av invasiva infektioner konfirmerande tester utförs för definitiv diagnostik av jÀstsvamp som vÀxer pÄ kromogena medier.

För övrigt hÀnvisas till artikeln Odling och substrat-svamp


GBS

Fortfarande orsakar GBS ett antal invasiva neonatala early onset-infektioner. Smittan överförs till barnet via vagina hos koloniserade mödrar i samband med förlossningen. Oavsett vilket fast substrat som anvÀnds för primÀridentifieringen skall varje screeningsprov för GBS anrikas i selektiv anrikningsbuljong. Olika fasta differentierande substrat finns tillgÀngliga, bland andra Islam-agar (modifierad som Grananda-medium) som bygger pÄ egenskapen hos hemolytiska GBS-isolat att producera ett orange-fÀrgat pigment. BÄde sensitivitet och specificitet blir lidande av att ickehemolytiska GBS-isolat inte producerar pigment, varför kromogena substrat för organismerna har utvecklats. Dessa har rapporterats ha högre kÀnslighet Àn blod-agar och Granada-medium (Roure et al. 2006).

Kromogena substrat för detektion av antibiotikaresistenta bakterier i kliniska prov

Ett antal kromogena substrat finns tillgÀngliga för primÀrisolering och presumtiv identifiering av olika typer av antibiotikaresistens. Dessa baseras pÄ kromogena media som gjorts selektiva genom tillsats av antibiotika. Substrat finns (2011) för MRSA, VRE, ESBL. Generellt hÀnvisar vi till gÀllande referensmetodik avseende pÄvisande av antibiotikaresistenta bakterier (REF) och inget av substraten rekommenderas som referenssubstrat.

VRE: I en studie av Malhotra-Kumar et al 2009 presenterades resultaten av en jĂ€mförelse mellan fyra olika fasta substrat av vilka tvĂ„ var avsedda för selektiv isolering av glykopeptidresistenta enterokocker frĂ„n fecesprov. Författarna konkluderade att de selektiva substraten fungerade bra med kĂ€nslighetsnivĂ„er pĂ„ 98-99 %. Det skall observeras att nivĂ„n av vankomycin Ă€r 8 mg/L i flera kromogena substrat för VRE, vilket kan innebĂ€ra att en del av lĂ„ggradigt resistenta stammar kan missas med sĂ„dana substrat. I gĂ€llande referensmetodik rekommenderas nivĂ„n 4 mg/L för optimal kĂ€nslighet för isolering av enterokocker med vanB-gener.

MRSA: Ett antal kromogena substrat för detektion av MRSA finns tillgĂ€ngliga. Över tid har olika selektiva antibiotika anvĂ€nts i dessa (meticillin, oxacillin, cefoxitin) varvid medier med cefoxitin uppvisat bĂ€st kĂ€nslighet, vilket möjligen kan förklaras av att den substansen inducerar PBP2ÂŽeffektivare Ă€n de andra. Andra antibiotikakombinationer förekommer ocksĂ„ och kĂ€nsligheten avseende pĂ„visande av MRSA i olika prover Ă€r med nyare medier mycket hög (>99 %, Perry and FreydiĂšre, 2007).

Kromogent ESBL-medium (bioMerieux) med screeningprov frÄn feces. TvÄ olika kolonityper kan urskiljas (E. coli och Enterobacter species). Foto; Camilla Svensson

ESBL-producerande bakterier: FĂ€rdigberedda plattor eller supplement till kromagarfabrikat för pĂ„visning av ESBL-producerande Enterobacteriaceae finns tillgĂ€ngliga. Dessa innehĂ„ller olika antibiotikablandningar, exempelvis med cefpodoxim som ett av dessa, för att bli selektiva för ESBL-producerande bakterier. I en studie pĂ„ fecesprover (Glupczynski et al, 2007) jĂ€mfördes det selektiva kromogena mediet ESBL-Bx, bioMĂ©rieux, med egentillverkade MacConkey-plattor med ceftazidim 2 mg /L. KĂ€nsligheten avseende pĂ„visande av ESBL var 97.7 % för ESBL-Bx mot 84.1 % för de egentillverkade plattorna. Kromogena substrat marknadsförs ocksĂ„ för selektiv isolering av CTX-M-ESBL. I en studie (Randall et al 2009) rapporteras ett sĂ„dant medium ha en kĂ€nslighet motsvarande 100 % för selektiv isolering av Enterobacteriaceae med bland annat CTX-M-gen.

Selektiva kromogena substrat för rutinpÄvisning av karbapenemasproducerande Enterobacteriaceae finns men anvÀnds hittills endast i begrÀnsad omfattning (Perry et al 2011, Vrioni et al 2012). Dessa Àr Ànnu inte utvÀrderade avseende prestanda och behovet för humant bruk. Se ocksÄ artikeln Screeningmetodik för ESBL.

LĂ€nkar

REFERENSER

  • 1. Perry, J.D. and FreydiĂšre, A.M. The application of chromogenic media in clinical microbiology. J Appl Microbiol 2007;103:2046-2055
  • 2. Whittier, S. and Della-Latta, P. Evaluation of BBL CHROMagar Orientation Agar for Routine Urine Cultures in a High Volume Clinical Laboratory. As presented at the 105th General Meeting of the ASM, 2005.
  • 3. Aspevall, O., et al. Performance of Four Chromogenic Urine Culture Media after One or Two Days of Incubation Compared with Reference Media. J Clin Microbiol. 2002:40;1500-1503
  • 4. Svensson, C. Prövningsrapport, KML XII:15 CPS ID 3 Agar. Laboratoriemedicin, Klinisk mikrobiologi, VĂ€sterĂ„s Sjukhus. 2009
  • 5. Perez, J.M., et al. Comparison of four chromogenic media and Hektoen agar for detection and presumptive identification of Salmonella strains in human stools. J Clin Microbiol. 2003;41:1130-1134.
  • 6. Eraso, E., et al. Evaluation of the new chromogenic medium Candida ID 2 for isolation of and identification of Candida albicans and other medically importatnt Candida species. J Clin Microbiol. 2006;55:524-529.
  • 7. Perry, J. D. et al Prevalence of faecal carriage of Enterobacteriaceae with NDM-1 carbapenemase at military hospitals in Pakistan, and evaluation of two chromogenic media. J Antimicrob Chemother. 2011;66:2288-94
  • 8. Glupczynski , Y., et al. Evaluation of a New Selective Chromogenic Agar Medium for Detection of Extended-Spectrum ÎČ-Lactamase-Producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol.2007:45;501-505
  • 9. Odds, F.C., and R. Bernaerts. CHROMagar Candida, a new differentiated isolation medium for presumptive identification of clinically important Candida species. J Clin Microbiol 1994;32:1923-1929.
  • 10. Perry, J.D. et al. Evaluation of S. aureus ID, a new chromogenic agar medium for detection of Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol. 2003;41:5695-5698.
  • 11. Murinda, S.E., et al. Phenotypic and genetic markers for serotype-specifik detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli O26 strains from North America. Foodborne Pathog Dis 2004;1:125-135
  • 12. Reissbrodt, R. New chromogenic plating media for detection and enumeration of pathogenic Listeria spp-an overview. Int J Food Microbiol. 2004;95:1-9
  • 13. Roure, C., et al. Prevention of perinatal group B streptococcal infections, evaluation of a new chromogenic medium STREPTO B ID. Abstract p798 in Abstracts of the 16th ECCMID, Nice, France.
  • 14. Malhotra-Kumar, S., et al. Evaluation of culture-based approaches for rapid detection of glycopeptides-resistant enterococci: a randomized, investigator-blinded study. Abstract number 0251. ESCMID 2009
  • 15. Randall, L.P., et al. Evaluation of CHROMagar CTX, a novel medium for isolating CTX-M-ESBL-positive Enterobacteriaceae while inhibiting AmpC-producing strains. J Antimicrob Chemother. 2009;63:302-308
  • 16. Nakashima, Y., et al. A Chromogenic Substrate Culture Plate for early identification of Vibrio vulnificus and Isolation of other marine Vibrios. Ann Clin Lab Science. 2007;37:330-334
  • 17. Vrioni, G., et al. Comparative evaluation of a prototype chromogenic medium (chromID CARBA) for detecting carbapenemase-producing Enterobacteriaceae in surveillance rectal swabs. J Clin Microbiol, published online ahead of print on 29 March 2012.