Bilagor till VRE-diagnostiken

Från Referensmetodik för laboratoriediagnostik
Hoppa till navigering Hoppa till sök

Artikel publicerad februari 2012. Texten är preliminär ännu ej godkänd genom konsensusförfarande


Till huvudartikeln Vankomycinresistenta enterokocker (VRE), referensmetodik


Bilagor till VRE-diagnostiken

Bilaga 1

Diagnostiska minimikriterier
 för artdiagnostik 
av enterokocker (referensmetodik)

  • Enterococcus spp: Minimikriterier:
 Typisk kolonimorfologi, grampositiv
, katalasnegativ, galla-eskulin-positiv, alternativt positiv i agglutinationstest för grupp D, PYR-positiv
. Andra egenskaper: Gråvita kolonier på blodagar, kan ha ingen hemolys, alfa- eller betahemolys, oftast gula kolonier på CLED-agar. Växer i buljong med 6,5 % NaCl 
(Tabell 4)
Tabell 4 enterokocker 0001.jpg


Bilaga 2


Anrikningsmedium för VRE-screening

  • Galla-eskulinbuljong (Referenssubstrat):
    • Typexempel Bile Esculin Azide Broth (Biolife) 42.7 g/L
    • Innehåll------ Gram/L
    • Trypton -------17
    • Pepton --------3
    • Jästextrakt------ 5
    • Oxgalla-------- 10
    • Natriumklorid------ 5
    • Natriumcitrat------ 1
    • Eskulin---------- 1
    • Fe-ammonium-citrat------ 0,5
    • Natriumazid-------0,25
  • pH 7.1± 0.2

Galla-eskulinbuljong tillreds enligt tillverkarens anvisningar. Tillsätt vankomycin 4 mg/L och aztreonam 60 mg/L.

  • Alternativ anrikningsbuljong (Todd-Hewittbuljong)
    • Typexempel:T-H-buljong (BD)
    • Innehåll --------Gram/L
    • Infusion av kött------ 3,1
    • Neopepton------20,0
    • Dextros------ 2,0
    • Natriumklorid------ 2,0
    • Dinatriumfosfat------ 0,4
    • Natriumkarbonat------ 2,5
  • pH 7,8± 0.2

Todd-Hewittbuljong tillreds enligt tillverkarens anvisningar. Tillsätt vankomycin 4 mg/L och aztreonam 60 mg/L.

Bilaga 3

PCR-metod för påvisande av van-gener


vanA och vanB PCR för LightCycler (FRET-hybridiseringsprobe)

Reaktionsvolymen är 20 μL varav 5 μl är templat. PCR mixen innehåller 1xHYB- master (Roche Diagnostics), 2 mM MgCl2, 1 μM av varje primer och 0.2 μM av varje hybridiserings-probe.


VanAochvanB LightCycler.jpg
  • Temperaturprofil LightCycler
    • 
Enzymaktivering: 95 oC 10 min. Slope 20 oC/s. 1 cykel.

    • Amplifiering: 95 oC 15 sek, 50 oC 15 sek, 72 oC 25 sek. 40 cykler. Slope 20 oC/s.
    • Kylning: 40 oC 60 sek. Slope 20 oC/s.


Avläsning med color compensation. VanA och vanB avläses i olika kanaler.

Smältpunktanalys behövs inte.


VanA och vanB PCR för Rotor-Gene (TaqMan probe)

Reaktionsvolymen är 20 μL varav 2 μl är templat. PCR mixen innehåller 1x perfeCta qPCR FastMix (Quanta bioscience), 0,2 μM av varje primer, 0,075 μM av varje Taqman-probe.


VanAochvanB Rotor-Gene.jpg
  • Temperaturprofil för Rotor-Gene

    • Enzymaktivering: 95 oC i 3 min
    • 
Amplifiering: 95 oC i 3 sek, 60 oC i 20 sek. 40 cykler.


VanA och vanB avläses i olika kanaler. Smältpunktanalys behövs inte.


PCR-metod för molekylärbiologisk verifiering av E. faecalis och E. faecium

DdlE-PCR för LightCycler: Reaktionsvolymen är 20 μL varav 4 μl är templat. PCR mixen innehåller 1x LC- master, 4 mM MgCl2, 0,5 μM av varje primer och 0,04 units/μL FastStart Taq DNA-polymeras.

LC-master innehåller 2x FastStart PCR-buffert (Roche diagnostics), 4 % DMSO (Sigma), 0,4 mM dNTP (Roche diagnostics), 0,2 mg/mL BSA (Roche diagnostics) och 1,2x SybrGreen I (Molecular Probes).


VerifieringEnterokocker.jpg


  • Temperaturprofil LightCycler
    • 
Enzymaktivering: 95 oC 10 min. Slope 20 oC/s. 1 cykel.
    • 
Amplifiering: 95 oC 15 sek, 54 oC 10 sek, 72 oC 25 sek. 35 cykler. Slope 20 oC/s.
    • Smältpunktsanalys: 60–90 oC. Slope 0,1 oC/s

    • Kylning: 40 oC 30 sek. Slope 20 oC/s.

Avläsning: Metoden är en cybergreenmetod och läses av i våglängd 530 nm. Positiva prov ska uppvisa en amplifieringskurva samt att produkten ska ha en smälttopp runt 84–85 oC.