Corynebacterium diphtheriae/C. ulcerans
Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Övre luftvägsinfektioner (ÖLI)
Till förgreningssidan Corynebacterium diphtheriae för fler artiklar om bakterien
Corynebacterium diphtheriae
Smittämnet
Difteri i smittskyddslagens mening är en sjukdom orsakad av toxinbildande Corynebacterium diphtherieae, en grampositiv stav. Toxinet som är ett ADP-ribosyltransferas bildas endast av stammar infekterade med vissa fager. Lokala svalginfektioner kan uppträda även med icke toxinbildande stammar. Någon spontan revertering från tox- till tox+ anses inte förekomma. Toxinnegativa stammar kan in vivo smittas av toxigena fager från toxinbildande stam vilket dock har mer teoretiskt intresse än praktisk betydelse. Toxinbildning förekommer även hos Corynebacterium ulcerans. Sådana stammar kan ge en difteriliknande sjukdomsbild men några större epidemiska utbrott har dock inte beskrivits hos människa.
Odlingsdiagnostik
Provtagning och transport
Misstänkt svalgdifteri: En vanlig bomullspinne rullas med kraft över membraner, vita beläggningar eller inflammerade områden i svalget. Lyft helst eventuella membraner och försök få med underliggande material.
Ett ytterligare prov från nasofarynx rekomnenderas ej generellt eftersom sammanställningar från senaste difteriepidemin i Sverige endast visar marginellt ökat utbyte med ett sådant förfarande. I det enskilda fallet kan nasofarynxprov fortfarande vara motiverat.
Misstänkt huddifteri och annan difteri (t ex konjunktiva, vulva). Rengör misstänkt sårområde med steril koksalt, avlägsna eventuella krustor och rulla provtagningspinnen med kraft i såret.
Transport till laboratoriet sker i SIFF transportmedium. Löffleragar har inte visats ge nämnvärda fördelar. Provet bör vara laboratoriet tillhanda inom 24 tim. 1 väntan på transport förvaras materialet i kylskåp. Remiss: Önskan om difteriodling måste särskilt anges på remissen eftersom rutinmässig odling av difteribakterier i allmänhet ej utförs. Vid misstanke om difteri bör dessutom laboratoriet varskos per telefon eftersom substraten måste specialberedas.
Primärisolering
- Basmedia - Referensmedia (1)
- a) MTM (Modified Tinsdale’s Medium). (bil Sa)
- b) Cystin/Tellurit blodagar (bil 5b)
Utodling och inkubering: Utstryk sker på substrat innehållande i princip hästblod - hästserum, tellurit och cystin. Sådana medier har god selektivitet. C. diphtheriae har förmåga att reducera cystin varvid bildas H2S som med tellurit ger en mörk telluriumförening. På blodfri agar uppträder denna som en mörkbrun halo kring kolonierna.
Inkubering i 37°C aerobt.
Avläsning, identifiering
Presumtiv diagnostik: Avläsning sker efter 1, 2 och 3 dygn. På tellurit blodagar är typiska kolonier gråbruna till svarta. På MTM-agar ses inom 2 dygn en mörkbrun halo runt misstänkta kolonier. Sådana kan emellertid också bildas av C. ulcerans, (7 oWs (Corynebacterium pseudotuberculosis) samt vissa streptokockstammar. C. diphtheriae är katalas- och vanligen nitratpositiv. Undantag utgör subtyp belfanti som inte reducerar nitrat (1). Det är viktigt med positiva kontroller eftersom MTM-agarn kan vara nyckfull. Gramfärga misstänkta kolonier. Leta efter grampositiva eller gramlabila stavar i typisk ”pallisadformation”.
Slutlig verifiering
Biokemiska kriterier
Den klassiska uppdelningen i C diphtheriae gravis, intermedius och mitis återspeglar inte en fallande klinisk svårighetsgrad. Eftersom jäsningsmönstren för intennedius och mitis dessutom är identiska har dessa sammanförts som nongravis.
Toxinbildning: Alla isolat av C dihtheriae skall undersökas med avseende på toxinbildning. Referensmetod är subkutan injektion på marsvin efter 24 tim inkubering i BHI. I vana händer utgör dock geldiffusion enligt Elek-Ouchterlony ett fullgott alternativ. PCR-metod finns beskriven för påvisning av tox-genen. Metodbeskrivning och tolkning av toxintest (se bilaga 15)
Toxinnegaliva difteristammar och sådana med osäker biokemi eller toxinbildning bör sändas till referenslaboratorium för verifiering. Även enstaka isolat utan epidemiologisk bakgrund bör sändas för verifiering.
Indikationer för resistensbestämning Isolerade difteribakterier är i allmänhet känsliga för penicillin och erytromycin, varför resistensbestärnning sällan blir aktuell.
Svarsrutiner Stam som visar biokemi typisk för Corynebacterium diphtheriae och är toxinbildande i gel-diffusionstest enligt Elek-Ouchterlony svaras Corynebacterluim diphtheriae gravis/nongravis, toxinbildande. Motsvarande stam som ej bildar toxin svaras Corynebacterium diphtheriae ej toxinbildande.
Alternativa metoder för påvisande av difteribakterier Någon tillförlitlig snabbmetodik för diagnosen difteri finns för närvarande inte tillgänglig. Direktpreparal för mikroskopi är ofta svårbedömda även med specialfärgningar. Såväl falskt positiva som falskt negativa resultat är vanliga. Avsaknad av Grampositiva stavar i ett direktpreparat kan dock ge viss klinisk vägledning.
Epidemiologisk typning Epidemiologisk typning kan vara värdefull vid större utbrott varvid såväl fagtypning som restriktionsenzymanalys är beprövade metoder. Av de stammar som isolerades i Sverige 1984-86 tillhörde de allra flesta fagtyp 20 (2). Referensstammar Corynebacterium diphtheriae nongravis: CCUG 16574, tox + Corynebocterium diphtheriae: CCUG 5863 (NCTC 3984), svagt tox + Corynebacterium diphtherioe nongravis: CCUG 5865 (NCTC 10356), tox- Corynebacterium diphtheriae gravis: CCUG 5864 (NCTC 10648), tox+ Corynebacteriurn ulcerans: CCUG 18646, tox+
Antikroppsbestämning Metodik för bestämning av difteriantitoxin behandlas i annat sammanhang. Antikroppsbestämning används sällan i diagnostiskt syfte.
Laboratorierapportering Toxinbildande C diphtheriae anmäls alltid.
REFERENSER 1. Brooks It Guidelines for the laboratory diagnoits of diphtheria. WHO Lab 81-7.
2 Hallander H, Haeggnan 8, Löfdahl 5. Epidemiological typing of Corynebacterium diphtlteriae isotated in Swedcn t984-1956. Scand J lnfe