Skillnad mellan versioner av "Identifiering-Pneumocystis jiroveci"

Nuvarande version från 14 januari 2014 kl. 16.13

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Svampinfektioner

Se också Pneumocystis jiroveci-pneumoni (PCP)

Identifiering och minimikriterier, svamp

Pneumocystis jiroveci (tidigare carinii)[redigera]

Direktpåvisande[redigera]

Definitiv diagnos av P. jiroveci-pneumoni (PCP) kan fås genom att påvisa organismen i luftvägsprov. Detta kan ske med metenaminsilverfärgning, toluidinblått, modifierad Giemsa, eller genom immunfluorescens med monoklonala antikroppar. Den sista metoden är mycket specifik och känslig och utförs vid Folkhälsomyndigheten samt vid Bakt.lab., Sahlgrenska Universitetssjukhuset (bilaga 8).

Den känsligaste metoden för att påvisa P. jiroveci är polymeraskedjereaktionen (PCR), med vilken en specifik DNA-sekvens från organismen detekteras i sputum eller BAL (utförs vid Folkhälsomyndigheten). PCR kan emellertid vara positiv i avsaknad av pågående, genomgången eller framtida PCP. Därför bör man överväga möjligheten att P. jiroveci koloniserar luftvägarna.

Sensitiviteten beror i hög grad på provmaterialet: sputum ger lågt utbyte, inducerat sputum mellan 25-80 %, bronkoalveolär sköljning är mycket effektiv med >95 %, transbronkial biopsi är också känslig med 85-95 % sensitivitet.

Serologisk metodik[redigera]

Serologi för P. jiroveci-antikroppar har begränsat värde hos icke HIV-infekterade personer och har ingen praktisk betydelse hos HIV-patienter. Ungefär 50 % av icke-HIV patienter och endast 3 % av HIV-patienter hade titerstegring med indirekt IF under PCP. Påvisning av P. jiroveci-antigen i serum ansågs tidigare vara en känslig metod men har senare visat sig vara bristfällig avseende både sensitivitet och specificitet.

@@ Rad 1: / Rad 1: @@
 ''Till innehållsförteckningen för [[Referensmetodik:Svampinfektioner]]''
+----
+Se också [[Pneumocystis jiroveci-pneumoni (PCP)]]
 ----
 '''Identifiering och minimikriterier, svamp'''
+== ''Pneumocystis jiroveci'' (tidigare ''carinii'') ==
-== Jäst ==
-Jäst är svampar som huvudsakligen förökar sig genom knoppning (blastokonidier). Till skillnad från mögelsvampar, vilka identifieras genom makro- och mikroskopisk morfologi, identifieras de i allmänhet i laboratoriet genom en kombination av biokemiska och morfologiska egenskaper (se nedan '''Tabell 8, Fig 3'''). De flesta jästarter växer bra på vanliga bakterie- och
-svampmedier (undantag ''Malassezia furfur''). Växt ses vanligen inom 1-3 dygn. De flesta jästisolat som påvisats i laboratoriet tillhör släktet ''Candida''. I kliniska material i Sverige utgör ''C. albicans'' ofta ca 70 % av jästisolaten. Övriga ''Candida''-arter står för merparten av de resterande.
-Övriga släkten som förekommer av och till är ''Cryptococcus'', ''Saccharomyces, Hansenula, Rhodotorula'' och ''Trichosporon''. Geotrichum-arter tas också med här även om dessa svampar förökar sig genom fragmentering av hyfer i artrokonidier. Deras kolonier liknar dock jäst.
-Eftersom ''C.albicans'' är vanligast och även lättidentifierad genom att den bildar karakteristiska groddslangar och klamydokonidier samt gröna kolonier på CHROMagar börjar jästtypning med att identifiera eller utesluta ''C. albicans'' ( '''Fig 3''' ). Vid mukoida isolat samt vid klinisk kryptokockmisstanke görs tuschpreparat för att påvisa kapsel, som dock kan saknas i kultur.
+=== Direktpåvisande ===
-=== Jästkarakteristika ===
+Definitiv diagnos av ''P. jiroveci''-pneumoni (PCP) kan fås genom att påvisa organismen i luftvägsprov. Detta kan ske med metenaminsilverfärgning, toluidinblått, modifierad Giemsa, eller genom immunfluorescens med monoklonala antikroppar. Den sista metoden är mycket specifik och känslig och utförs vid Folkhälsomyndigheten samt vid Bakt.lab., Sahlgrenska Universitetssjukhuset ([[8. Adresser-svamp|bilaga 8]]).
-När en jästsvamp förlängs genom knoppning bildas en pseudohyf som saknar septa. Under vissa förhållanden, i synnerhet vid växt i brist på syrgas, kan vissa jästarter även bilda äkta, septerade, hyfer. Både pseudohyfer och äkta hyfer bildar mycel i substraten. ''C. albicans'' bildar i serum och vissa albuminhaltiga lösningar groddslangar, som uppträder som jämntjocka hyfliknande utskott från blastokonidier, när dessa inkuberas någon timme vid 37 °C.
+Den känsligaste metoden för att påvisa ''P. jiroveci'' är polymeraskedjereaktionen (PCR), med vilken en specifik DNA-sekvens från organismen detekteras i sputum eller BAL (utförs vid Folkhälsomyndigheten). PCR kan emellertid vara positiv i avsaknad av pågående, genomgången eller framtida PCP. Därför bör man överväga möjligheten att ''P. jiroveci'' koloniserar luftvägarna.
-''C. albicans'' kan även bilda klamydokonidier, vilka vanligen uppträder i änden av en pseudohyf som stora, sfäriska, starkt refraktila celler. Generellt kan sägas, att de morfologiska kriterierna utgör utgångspunkten för släktetillhörighet, medan biokemiska kriterier i form av kolhydrat och nitratassimilation samt kolhydratjäsning används för att identifiera de enskilda arterna. Dock är ibland även den mikroskopiska växten på vissa medier karakteristisk för de enskilda arterna, i synnerhet gäller detta ''Candida''-släktet, men biokemiska tester är nödvändiga för att identifiera andra arter än ''C. albicans''.
+Sensitiviteten beror i hög grad på provmaterialet: sputum ger lågt utbyte, inducerat sputum mellan 25-80 %, bronkoalveolär sköljning är mycket effektiv med >95 %, transbronkial biopsi är också känslig med 85-95 % sensitivitet.
-=== Karakteristika för släkten med medicinsk betydelse ===
+=== Serologisk metodik ===
-har sammanfattats i nedanstående tabell.
+Serologi för ''P. jiroveci''-antikroppar har begränsat värde hos icke HIV-infekterade personer och har ingen praktisk betydelse hos HIV-patienter. Ungefär 50 % av icke-HIV patienter och endast 3 % av HIV-patienter hade titerstegring med indirekt IF under PCP. Påvisning av ''P. jiroveci''-antigen i serum ansågs tidigare vara en känslig metod men har senare visat sig vara bristfällig avseende både sensitivitet och specificitet.
-[[Fil:Svamptabell8.jpg]]
 ----
-[[Fil:Svampfigur3.jpg]]
-----
-== Askomyceter ==
-'''''Candida'':''' ''Candida'' är asexuella stadier (anamorf) av askomycet-jäster representerande flera olika arter, släkten och familjer. Cellerna varierar i form och storlek. Förökningen sker vanligen genom multilateral knoppning. Pseudohyfer eller äkta hyfer kan förekomma. I tidigare taxonomi, som fortfarande upprätthålls i USA, särskildes ''Torulopsis'' som ett släkte, som
-icke bildar pseudohyfer eller hyfer. Den vanligaste representanten för denna grupp, ''C. glabrata (Torulopsis glabrata'') karakteriseras av att regelbundet bilda små sfäriska celler (Tabell 10, sid 93).
-Synlig pigmentering till följd av karotenoida pigment förekommer inte. Fermentation förekommer vanligen.
-'''''Saccharomyces'':''' Släktet ''Saccharomyces'' assimilerar inte nitrat och bildar askosporer med jämn vägg. Fermentation förekommer och utnyttjas för bl.a. brödjäsning (''S.cerevisiae'') samt öl-, vin- och annan etanoltillverkning.
-'''''Hansenula (Pichia) anomala'':''' ''Hansenula anomala'' assimilerar nitrat och bildar hattformade, halvsfäriska eller saturnusformade askosporer.
-'''''Geotrichum'':''' Släktet ''Geotrichum'' bildar inte blastokonidier och har bara hyfer, vilka fragmenteras i typiska rektangulära artrokonidier. Den växer som platta pudriga kolonier och är anamorf. Växten är dålig vid 37 °C.
-== Basidiomyceter ==
-=== Kryptokocker ===
-Släktet ''Cryptococcus'' karakteriseras av kapselförsedda celler. Graden av kapselbildning beror på odlingsmedium samt variationer mellan enskilda stammar. Alla species är ureaspositiva och assimilerar inositol men fermenterar icke. Endast ''C. neoformans'' växer vid 37 °C.
-De enda kända patogena arterna '''''C. neoformans''''' och möjligtvis även '''''C. albidus''''' har ett sexuellt stadium, som tillhör släktet ''Filobasidiellainom'' inom basidiomyceterna. Fem serotyper av ''C. neoformans'' (A, B, C, D och AD) har beskrivits, vilka är kopplade till de sexuella faserna. Följaktligen har ''C. neoformans'' blivit reklassificerad i två varianter ''C. neoformans'' var. ''neoformans'' (serotyperna A och D) och ''C. neoformans'' var. ''gattii'' (serotyperna B och C) relaterade till de två sexuella tillstånden ''Filobasidiella neoformans'' var. ''neoformans'' resp. ''F. neoformans'' var. ''bacillispora''. De kan differentieras med kanavaninagar ([[3. Referenssubstrat-svamp|Bilaga 3]]).
-'''''Trichosporon'':''' Släktet ''Trichosporon'' karakteriseras av att bilda artrokonidier utöver blastokonidier och hyfer. Detta ses lättast på majsagar ([[3. Referenssubstrat-svamp|Bilaga 3]]).
-'''''Rhodotorula'':''' Släktet ''Rhodotorula'' karakteriseras av att spjälka urea och bilda röda eller gula karotenoida pigment samt att inte assimilera inositol. ''Rhodotorula'' saknar pseudomycel. Fermentation förekommer ej.
-== Typningsmetoder ==
-Ett flödesschema för typning av jästisolat visas i '''Fig 3'''. Det finns två snabba test, som behöver utföras initialt, när ett jästisolat först påvisas i laboratoriet. Icke mukoida kolonier prövas på bildning av groddslang. Om detta är positivt är det fråga om ''Candida albicans''. Det mukoida isolatet prövas med tusch -om kapsel påvisas är det kryptokocker varvid kompletterande biokemiska tester behövs för artbestämning. Om groddslang inte bildas och kapsel inte finns måste man gå vidare med odlingstester inklusive biokemiska tester, som tar två till sju dygn för artbestämning.
-=== Bildning av groddslangar ===
-Bildning av groddslangar är en snabb identifieringsmetod för ''Candida albicans'' som kan utföras på primärisolat eller renkultur. Bildningen av groddslangar i serum eller likartade medier kan under optimala förhållanden påvisas hos 95-97 % av kliniska isolat av ''Candida albicans''. Falskt negativa resultat kan uppkomma om ursprungskulturen inte gått in i stationärfas. Förutom ''C. albicans'' ger ''C. dubliniensis'' positiv groddslangtest. ''D. dubliniensis'' är ett nyligen beskrivet species som
-isolerats från HIV-patienter med oral candidos (Sullivan et al., 1995, Pinjon et al., 1998).
-Testet utförs på följande sätt:
-*1. Placera 0,5 mL häst-, human- eller kalvserum (citratplasma går också bra) alternativt hönsalbumin i ett litet provrör. Tillsats av 0,5 -1 % glukos påskyndar groddslangbildning.
-*2. Suspendera en liten del av en jästkoloni i mediet.
-*3. Inkubera vid 37 °C i termostat 1,5- 3 timmar.
-*4. Överför därefter en droppe från odlingen till ett objektglas, lägg på ett täckglas och granska i mikroskop om groddslangar bildats. Groddslangar uppträder som cylindriska trådar, som utgår från blastokonidien utan någon insnörning vid utgångspunkten och utan någon påtaglig expansion längs tråden ('''Fig 4''').
-[[Fil:Svampfigur4.jpg]]
-----
-=== Kapselbildning ===
-Om kolonin är mukoid eller om patientens sjukhistoria ger anledning till misstanke, bör man försöka påvisa kapsel, som är ett kännetecken för kryptokocker ([[2. Direktmikroskopi, svamp (Blankophor- och Tuschfärgning)-svamp|bilaga 2]]). Kapselantigen kan påvisas med latexagglutinationstest, som är specifik för ''C. neoformans''.
-Om kapsel påvisas utförs assimilationstest för att bestämma kryptokockart och även test för fenoloxidas (se [[3. Referenssubstrat-svamp|Bilaga 3]]).
-=== Bildning av pseudohyfer och klamydokonidier ([[Tabell 10]]) ===
-Följande medier förekommer kommersiellt och är lämpliga för att få fram bildning av pseudohyfer, hyfer och klamydokonidier: “corn meal”(majsmjöl)-agar med TWEEN 80 helst utan glukos ([[3. Referenssubstrat-svamp|Bilaga 3]]), natriumtaurokolatagar ([[3. Referenssubstrat-svamp|Bilaga 3]]), och potatisglukosagar ([[3. Referenssubstrat-svamp|Bilaga 3]]).
-Om denna typningsprocedur utförs sällan kan 15 mL substrat förvaras i provrör med skruvlock och smältas för att gjuta en agarplatta inför användningen. Om flera typningar utförs samma dag kan plattan delas i fyra till åtta sektorer.
-*1. Ta en liten del av en jästkoloni med en plastögla, platinaspets eller agarkniv (tillhamrad platinatråd) och dra parallella rispor i agarmediet för att provocera mycelbildning. Placera ett sterilt täckglas över inokulatet.
-*2. Inkubera vid 27-30 °C i upp till tre dagar.
-*3. Efter 48 tim. odling kan plattan avläsas mikroskopiskt. Börja med låg förstoring, senare med 40x objektiv.
-''Candida''-arter med undantag av ''Candida glabrata'' bildar vanligen rikligt med pseudohyfer, ibland äkta mycel, som växer ut i substratet från kanten av inokulatet. Grupper av ovala till sfäriska blastokonidier kan ofta iakttas längs hyferna. Hyfernas och blastokonidiernas inbördes placering är ofta karakteristiska för den enskilda arten. Stora, starkt refraktila, tjockväggiga
-klamydokonidier kan iakttas i änden eller på korta sidogrenar av hyfer hos ''C. albicans.'' De flesta kliniska isolat av ''C. albicans'' bildar klamydokonidier, vilket är ett unikt attribut för arten.
-== Biokemiska tester och specialsubstrat (Tabell 9) ==
-'''Kolhydratfermentationstester''' är diskriminerande särskilt ihop med assimilationstester. De skulle kunna användas i större omfattning än vad som är fallet (se [[Tabell 10]]).
-== Referensmetodik ==
-=== Fermentation ===
-'''Princip'''
-Jästsvampens förmåga att jäsa vissa sockerarter påvisas med gasbildning. Gasen fångas upp i små upp-och-nervända durhamrör i jäsningsrören. Olika arter har skilda jäsningsmönster, skillnad även med avseende på hur starkt och hur snabbt sockerarten fermenteras. Detta markeras i referensböckerna med “w” för weak och “d” för delayed efter aktuell sockerart för de olika svamparna.
-'''Utförande'''
-Jästsvampen slammas i NaCl till en täthet av ca 1 McFarland, 1 droppe inokuleras till varje sockerjäsningsrör ([[3. Referenssubstrat-svamp|Bilaga 3]]), inkuberas vid 25 30 °C och studeras med 2-3 dagars mellanrum upp till 10 dagar, varvid omskakas för att notera ev. begynnande jäsning. Denna ses som små gasbubblor som stiger i röret. Om jästen använder sockret i röret aerobt växer den i övre delen av röret och adapteras till sockret ifråga. Den adapterade jästen sjunker till botten där syrekoncentrationen är låg. Här kan sockret metaboliseras anaerobt och CO<sub>2</sub>-bubblor stiger upp i det inverterade röret. Jäsningsförmågan mäts genom att notera hur mycket gas som bildats, hur snabbt och från vilka sockerarter. Rekommenderade socker är D-glukos, D-galaktos, sackaros, maltos, laktos, trehalos och raffinos.
-=== Assimilation ===
-'''Princip'''
-Bestämning av förmågan hos jästsvamp att använda en enda kolkälla (sockerart) vid aerob växt. Assimilation betyder att svampen tar upp och bryter ner sockret ifråga. Denna förmåga undersöks genom att tillsätta svampen till en kolhydratfri agar och därefter tillföra sockerarter. Växt runt sockerarten visar att svampen har förmåga att assimilera denna.
-'''Utförande'''
-Jästsvampen slammas i NaCl till ca 2 McFarland. 0,5 mL av denna suspension hälls i en petriskål (9 cm diameter). Tillsätt ca 10 mL smält avsvalnad (40-42 °C) assimilationsagar ([[3. Referenssubstrat-svamp|Bilaga 3]]). Blanda agarn och svampsuspensionen noga genom att snurra plattan med- och motsols. Lägg de olika sockren (en knivsudd kristaller alt. sockerimpregnerade lappar) vid kanten på plattan när denna har stelnat. Fem olika sockerfår plats på varje platta. Antalet sockerarter som testas kan variera. För att få säker diagnostik bör dock minst 16 testas.
-Följande rekommenderas: D-glukos, D-galaktos, sackaros, maltos, laktos, cellobios, trehalos, melibios, raffinos,
-melezitos, xylos, L-sorbos, erytritol, D-mannitol, D-glucitol (=D-sorbitol) och inositol. Assimilationsmönster (auxanogram) fås genom att notera vilka socker svampen kan utnyttja för tillväxt. Plattorna inkuberas 2 dygn i 25-30 °C. Assimilation ses som en växtzon runt respektive sockerart. För tolkning av resultaten, se referenslitteraturen, t.ex. Barnett et al.
-'''RAT-test''' (Rapid Assimilation of Trehalose) utförs för att snabbidentifiera ''Candida glabrata''.
-Kolonier som testas skall ha små rundovala blastokonidier och ej pseudomycel. Svampkolonierna bör vara 2-4 dagar gamla. Endagarskolonier blir ofta negativa.
-*1) Häll 2-3 pasteurdroppar RAT-medium ([[3. Referenssubstrat-svamp|Bilaga 3]]) till en mikrotiterplatta, en brunn per test.
-*2) Slamma en full 1 µL-ögla jästsvamp till brunnen. Tjockt inokulat är viktigt för testets sensitivitet.
-*3) Inkubera plattan med lock i 37 °C 1-11/2 timme. Ta med ''C. glabrata'' (ATCC 90030) som positiv kontroll och ''C. albicans'' (ATCC 90028) som negativ kontroll vid varje testtillfälle.
-*4) Vid posisiv test för ''C. glabrata'' ändrar mediet färg från blått till gult/gulgrönt. Negativ test utesluter ej ''C. glabrata''.
-'''Nitratassimilation''' utförs antingen analogt med kolhydratsassimilation men med kvävefri agar eller används MKA-rör som inokuleras med en jästkoloni och inkuberas vid 25-30 °C, 2 dygn. Vid positiv assimilation ändras substratets färg från grön till blå ([[3. Referenssubstrat-svamp|Bilaga 3]]).
-==== Speciella tester för ''C. neoformans'' ====
-Kryptokockkolonin är vitbeige, ofta slemmig p.g.a. kapseln. Äldre (1 vecka) kolonier blir bruna. Alla kryptokocker är icke-fermentativa aerober.
-Fenoloxidasaktivitet, d.v.s. bildningen av melaninliknande pigment (orto-och parafenoler) används för snabb preliminär identifiering av ''C. neoformans''. Många olika substrat kan användas för att påvisa melaninbildning, t.ex. dopamin och dihydroxyfenylalanin (DOPA).
-Förmåga att bilda bruna kolonier på dessa substrat är tecken på förekomst av fenoloxidas ([[3. Referenssubstrat-svamp|Bilaga 3]]).
-Agarplattor med DOPA-medium inokuleras med misstänkt koloni ''C. neoformans'' och inkuberas vid 20-30 °C i minst 3 dagar. ''C. neoformans'' framträder som mörkbruna till svarta kolonier. Positiv och negativ kontroll odlas på varje platta ([[4. Substratkontroll-svamp|bilaga 4]]).
-'''Ureahydrolys''' ([[3. Referenssubstrat-svamp|Bilaga 3]]): Ureasbildning är ett karakteristikum, som är användbart för att identifiera kryptokocker och flera andra basidiomycetjästarter. Alla ''Rhodotorula'' och de flesta ''Trichosporon''-arter bildar också ureas. Mediet är Christensens ureaagar som även används för bakterier. Ett rör med ureamedium inokuleras med en ögla jästmaterial. Det är lämpligt att lägga till en positiv och negativ kontroll ([[4. Substratkontroll-svamp|bilaga 4]]). Rören inkuberas vid 25-30 °C. En rosa färg uppträder efter 2-5 dagar vid positiv reaktion p.g.a. alkaliskt pH genom ammoniakbildning.
-=== Diagnostiska kits ===
-Med den ökande kunskapen om att svampars genus- och speciestillhörighet också ger relativt säker terapeutisk vägledning har ett stort antal produkter för typning av jästisolat utvecklats och saluförts. De bygger oftast på identifiering av karakteristisk enzymbildning, vilket ibland kräver induktion på specifika medier. Stor följsamhet till producentens anvisningar om inokulat och inkuberingsförhållande krävs i allmänhet för goda resultat. Exempel på kits är ID32C och API20 Caux (bägge Bio Mérieux). På
-svenska mykologlaboratorier används sådana huvudsakligen för att komma vidare med atypiska isolat. Resultaten bör verifieras med mikromorfologi och andra metoder.
 [[Kategori:Svampinfektioner]]
-[[KAtegori:Laboratoriediagnostik-Svampinfektioner]]
+[[Kategori:Laboratoriediagnostik-Svampinfektioner]]
-[[Kategori:Minimikriterier-Svamp]]
+[[Kategori:Diagnostiska minimikriterier]]

Skillnad mellan versioner av "Identifiering-Pneumocystis jiroveci"

Nuvarande version från 14 januari 2014 kl. 16.13

Pneumocystis jiroveci (tidigare carinii)[redigera]

Direktpåvisande[redigera]

Serologisk metodik[redigera]

Navigeringsmeny

Sök