Skillnad mellan versioner av "RT-PCR för detektion av Norwalk-liknande humant calicivirus"

Från Referensmetodik för laboratoriediagnostik
Hoppa till navigering Hoppa till sök
 
(En mellanliggande sidversion av samma användare visas inte)
Rad 4: Rad 4:
  
 
----
 
----
'''EJ färdigredigerad'''
+
'''Uppdaterad februari 2010'''
 
 
== RT-PCR för detektion av Norwalk-liknande humant calicivirus ==
 
 
 
 
 
*Anti sense mix:
 
**Primer JV 13 50 pmol/L 1,0 X
 
**DEPC vatten 3,0 X
 
4,0
 
*1. Fördela  4 L av anti sense mixen till PCR-rör.
 
*2. Tillsätt 5 L av RNA-extraktionen till respektive PCR-rör.
 
*3. Denaturera vid 94 °C i 2 min.
 
*4 Kyl rören snabbt på is  minst 2 min och centrifugera.
 
 
 
 
 
RT-mix:
 
10 X PCR buffert pH 8,3 (100 mM Tris-HCL, 500 mM KCL) 1,5 X
 
MgCl2 25 mM 1,8 X
 
dNTP 10 mM 1,5 X
 
Superscript 0,5 X
 
DEPC vatten 0,7 X
 
6,0
 
1. Tillsätt 6 L av RT-mixen till respektive anti sense rör
 
2. Inkubera 60 min vid 42 °C, 5 min vid 94 °C, 4 °C
 
3. Kyl rören på is.
 
 
 
 
 
PCR MIX
 
10 X PCR buffert pH 9,2 (100 mM Tris-HCl, 750 mM KCl) 4,5 X
 
MgCl2 25 mM 2,4 X
 
dNTP 10 mM 0,5 X
 
JV 12 50 pmol/L 0,3 X
 
Taq 5 U/ /L 0,5 X
 
DEPC vatten                                 36,8 X
 
                                      45,0
 
1. Fördela 45 L av PCR mixen till nya PCR-rör.
 
2 Centrufugera cDNA proven och för därefter över 5 L  cDNA till respektive PCR-mix  rör.
 
 
 
 
 
3. PCR program :
 
3 min.94 °C, 40 (1 min. 94 °C, 1 min, 30 sek, 37 °C, 1 min, 72 °C)  7 min 74 °C, 4 °C
 
 
 
Primer JV 13: TCA TCA TCA CCA TAG AAA GAG
 
Primer JV 12:  ATA CCA CTA TGA TGC AGA TTA
 
 
 
Ref. Jan Vinjé. Molecular detection and epidemiology of small round-structured viruses (SRSV) in outbreakes of gastroenteritis in The Nederlands.
 
J Inf Dis 174:610-615  (1996)
 
 
 
 
  
 +
== RT-PCR för detektion av norovirus, sapovirus och astrovirus ==
  
 +
Som exempel på molekylärbiologisk metodik som används på flera svenska laboratorier som bas för metodiken kan nämnas en artikel publicerad i Journal of Virological Methods:
  
 +
Yan, H., Yagyu, F., Okitsu, S., Nishio, O., Ushijima, H. 2003. Detection of norovirus (GI, GII), Sapovirus and astrovirus i fecal samples using reverse transcription single-round multiplex PCR. J Virol Meth 114;37-44. 
  
 
[[Kategori:Laboratoriediagnostik-Infektioner i mage och tarm]]
 
[[Kategori:Laboratoriediagnostik-Infektioner i mage och tarm]]

Nuvarande version från 23 februari 2010 kl. 17.04

Till huvudartikeln Calicivirus

Sekundärartikel till Calicivirus-Laboratoriediagnostik


Uppdaterad februari 2010

RT-PCR för detektion av norovirus, sapovirus och astrovirus[redigera]

Som exempel på molekylärbiologisk metodik som används på flera svenska laboratorier som bas för metodiken kan nämnas en artikel publicerad i Journal of Virological Methods:

Yan, H., Yagyu, F., Okitsu, S., Nishio, O., Ushijima, H. 2003. Detection of norovirus (GI, GII), Sapovirus and astrovirus i fecal samples using reverse transcription single-round multiplex PCR. J Virol Meth 114;37-44.