Skillnad mellan versioner av "RT-PCR för detektion av Norwalk-liknande humant calicivirus"

Från Referensmetodik för laboratoriediagnostik
Hoppa till navigering Hoppa till sök
(Skapade sidan med '''Till huvudartikeln Calicivirus'' ''Sekundärartikel till Calicivirus-Laboratoriediagnostik'' ---- Kategori:Laboratoriediagnostik-Infektioner i mage och tarm')
 
Rad 4: Rad 4:
  
 
----
 
----
 +
'''EJ färdigredigerad'''
  
 +
== RT-PCR för detektion av Norwalk-liknande humant calicivirus ==
 +
 +
 +
*Anti sense mix:
 +
**Primer JV 13 50 pmol/L 1,0 X
 +
**DEPC vatten 3,0 X
 +
4,0
 +
*1. Fördela  4 L av anti sense mixen till PCR-rör.
 +
*2. Tillsätt 5 L av RNA-extraktionen till respektive PCR-rör.
 +
*3. Denaturera vid 94 °C i 2 min.
 +
*4 Kyl rören snabbt på is  minst 2 min och centrifugera.
 +
 +
 +
RT-mix:
 +
10 X PCR buffert pH 8,3 (100 mM Tris-HCL, 500 mM KCL) 1,5 X
 +
MgCl2 25 mM 1,8 X
 +
dNTP 10 mM 1,5 X
 +
Superscript 0,5 X
 +
DEPC vatten 0,7 X
 +
6,0
 +
1. Tillsätt 6 L av RT-mixen till respektive anti sense rör
 +
2. Inkubera 60 min vid 42 °C, 5 min vid 94 °C, 4 °C
 +
3. Kyl rören på is.
 +
 +
 +
PCR MIX
 +
10 X PCR buffert pH 9,2 (100 mM Tris-HCl, 750 mM KCl) 4,5 X
 +
MgCl2 25 mM 2,4 X
 +
dNTP 10 mM 0,5 X
 +
JV 12 50 pmol/L 0,3 X
 +
Taq 5 U/ /L 0,5 X
 +
DEPC vatten                                 36,8 X
 +
                                      45,0
 +
1. Fördela 45 L av PCR mixen till nya PCR-rör.
 +
2 Centrufugera cDNA proven och för därefter över 5 L  cDNA till respektive PCR-mix  rör.
 +
 +
 +
3. PCR program :
 +
3 min.94 °C, 40 (1 min. 94 °C, 1 min, 30 sek, 37 °C, 1 min, 72 °C)  7 min 74 °C, 4 °C
 +
 +
Primer JV 13: TCA TCA TCA CCA TAG AAA GAG
 +
Primer JV 12:  ATA CCA CTA TGA TGC AGA TTA
 +
 +
Ref. Jan Vinjé. Molecular detection and epidemiology of small round-structured viruses (SRSV) in outbreakes of gastroenteritis in The Nederlands.
 +
J Inf Dis 174:610-615  (1996)
 +
 +
  
  

Versionen från 24 augusti 2009 kl. 12.15

Till huvudartikeln Calicivirus

Sekundärartikel till Calicivirus-Laboratoriediagnostik

EJ färdigredigerad

RT-PCR för detektion av Norwalk-liknande humant calicivirus

  • Anti sense mix:
    • Primer JV 13 50 pmol/L 1,0 X
    • DEPC vatten 3,0 X

4,0

  • 1. Fördela 4 L av anti sense mixen till PCR-rör.
  • 2. Tillsätt 5 L av RNA-extraktionen till respektive PCR-rör.
  • 3. Denaturera vid 94 °C i 2 min.
  • 4 Kyl rören snabbt på is minst 2 min och centrifugera.


RT-mix: 10 X PCR buffert pH 8,3 (100 mM Tris-HCL, 500 mM KCL) 1,5 X MgCl2 25 mM 1,8 X dNTP 10 mM 1,5 X Superscript 0,5 X DEPC vatten 0,7 X 6,0 1. Tillsätt 6 L av RT-mixen till respektive anti sense rör 2. Inkubera 60 min vid 42 °C, 5 min vid 94 °C, 4 °C 3. Kyl rören på is.


PCR MIX 10 X PCR buffert pH 9,2 (100 mM Tris-HCl, 750 mM KCl) 4,5 X MgCl2 25 mM 2,4 X dNTP 10 mM 0,5 X JV 12 50 pmol/L 0,3 X Taq 5 U/ /L 0,5 X DEPC vatten 36,8 X 45,0 1. Fördela 45 L av PCR mixen till nya PCR-rör. 2 Centrufugera cDNA proven och för därefter över 5 L cDNA till respektive PCR-mix rör.


3. PCR program : 3 min.94 °C, 40 (1 min. 94 °C, 1 min, 30 sek, 37 °C, 1 min, 72 °C) 7 min 74 °C, 4 °C

Primer JV 13: TCA TCA TCA CCA TAG AAA GAG Primer JV 12: ATA CCA CTA TGA TGC AGA TTA

Ref. Jan Vinjé. Molecular detection and epidemiology of small round-structured viruses (SRSV) in outbreakes of gastroenteritis in The Nederlands. J Inf Dis 174:610-615 (1996)

Hämtad från "http://referensmetodik.folkhalsomyndigheten.se/index.php?title=RT-PCR_för_detektion_av_Norwalk-liknande_humant_calicivirus&oldid=1682"