RT-PCR för detektion av Norwalk-liknande humant calicivirus
Till huvudartikeln Calicivirus
Sekundärartikel till Calicivirus-Laboratoriediagnostik
EJ färdigredigerad
RT-PCR för detektion av Norwalk-liknande humant calicivirus
- Anti sense mix:
- Primer JV 13 50 pmol/L 1,0 X
- DEPC vatten 3,0 X
4,0
- 1. Fördela 4 L av anti sense mixen till PCR-rör.
- 2. Tillsätt 5 L av RNA-extraktionen till respektive PCR-rör.
- 3. Denaturera vid 94 °C i 2 min.
- 4 Kyl rören snabbt på is minst 2 min och centrifugera.
RT-mix:
10 X PCR buffert pH 8,3 (100 mM Tris-HCL, 500 mM KCL) 1,5 X
MgCl2 25 mM 1,8 X
dNTP 10 mM 1,5 X
Superscript 0,5 X
DEPC vatten 0,7 X
6,0
1. Tillsätt 6 L av RT-mixen till respektive anti sense rör
2. Inkubera 60 min vid 42 °C, 5 min vid 94 °C, 4 °C
3. Kyl rören på is.
PCR MIX
10 X PCR buffert pH 9,2 (100 mM Tris-HCl, 750 mM KCl) 4,5 X
MgCl2 25 mM 2,4 X
dNTP 10 mM 0,5 X
JV 12 50 pmol/L 0,3 X
Taq 5 U/ /L 0,5 X
DEPC vatten 36,8 X
45,0
1. Fördela 45 L av PCR mixen till nya PCR-rör.
2 Centrufugera cDNA proven och för därefter över 5 L cDNA till respektive PCR-mix rör.
3. PCR program :
3 min.94 °C, 40 (1 min. 94 °C, 1 min, 30 sek, 37 °C, 1 min, 72 °C) 7 min 74 °C, 4 °C
Primer JV 13: TCA TCA TCA CCA TAG AAA GAG Primer JV 12: ATA CCA CTA TGA TGC AGA TTA
Ref. Jan Vinjé. Molecular detection and epidemiology of small round-structured viruses (SRSV) in outbreakes of gastroenteritis in The Nederlands. J Inf Dis 174:610-615 (1996)