Cellodling Chlamydia trachomatis-bilaga2

Hoppa till: navigering, sök

Huvudartikel: Klamydia

SekundÀrartikel till: Klamydia-laboratoriediagnostik


PrimÀrisolering och identifiering av Chlamydia trachomatis med cellodling (modifierad frÄn Ripa & MÄrdh (1)

Substratrecept

Klamydiamedier.jpg


Cellslag

Mykoplasmafria McCoy-celler med dokumenterad förmÄga att vara vÀrdcell för förökning av C. trachomatis anvÀnds. Regelbunden kontroll för mykoplasmakontamination med PCR eller mykoplasmaodling rekommenderas.

Metod för primÀrisolering

För cellpropagering och spÀdning av prov anvÀnds RPMI 1640 med tillsatser enligt recept 2.1.2 ovan.

Efter provsÀttning kompletteras detta medium med glukos och cykloheximid enligt recept 2.1.3. Observera att ny uttitrering av lÀmplig cykloheximidkoncentration (0,5-2,0 mg/L) bör göras vid varje ny beredning av cykloheximid. LikasÄ bör cykloheximidkoncentrationen uttitreras vid cellbyte. Denna uttitrering görs med kontroller enligt nedan och cykloheximidkoncentrationer 0,5-2,0 mg/L i 0,5 mg steg.

Cellodlingsförfarande enligt gĂ€ngse normer. Cellerna kan propageras pĂ„ 250 mL plastflaskor eller större plast- eller glasflaskor efter behov. Celler för provsĂ€ttning passeras efter 2-4 dagar i tĂ€thet 1,5-2x10^5 celler/mL (den erforderliga celltĂ€theten beror pĂ„ hur snabbt cellerna vĂ€xer ut till ett konfluerande lager – för exakt inokulation rĂ€knas cellerna i BĂŒrkerkammare). Till varje brunn i 24-hĂ„ls cellodlingsplattor sĂ€tts 1 mL cellodlingsmedium med celler. Cellsuspensionen ska efter 1 dygns inkubering ge ett konfluerande cellager.


ProvsÀttning

Upptining av prov som varit frysta bör ske snabbt (37 °C vattenbad). Transportröret med isittande provtagningspinne skakas i Vortex, eventuellt med cirka 10 glaspÀrlor i röret. Grumliga prov (i allmÀnhet cervix) spÀdes med cellodlingsmedium 1:1, och centrifugeras 2-300xg, 5 min. FrÄn varje prov sÀtts till 2 brunnar: 0,5 mL ospÀtt prov + 0,5 ml cellodlingsmedium eller 1 mL spÀtt prov. Resten av provet fryses Äter vid -20-70 °C.

Vid varje analystillfÀlle sÀtts Àven positiv och negativ kontroll. Plattorna centrifugeras vid 3000xg, 37 °C i 1 timme. Plattorna inkuberas sedan vid 37 °C i 2 timmar,CO2-termostat. DÀrefter byts till provsÀttningsmedium och plattorna inkuberas vid 37 °C i 2 dygn i CO2-termostat.

FĂ€rgning

Medium avsugs frĂ„n varje brunn. Cellerna fixeras i 1 mL 95 % etanol i 10 min. Etanolen hĂ€lls av. Cellerna fĂ€rgas med fluoresceinmĂ€rkta monoklonala antikroppar mot C. trachomatis enligt fabrikantens instruktion. AvlĂ€sning sker i UV-mikroskop med filterkombination för fluoresceinisotiocyanat. För översiktsavlĂ€sning anvĂ€nds x10 objektiv och för verifiering av misstĂ€nkt inklusion x40. En typiskt fluorescerande inklusion per brunn Ă€r tillrĂ€ckligt för att ange provet som positivt. Den tidigare anvĂ€nda jodfĂ€rgningen ger lĂ€gre diagnostisk kĂ€nslighet genom att fĂ€rre typiska inklusioner ses i cellmattan (2)


Kontroller

Den positiva kontrollen titreras i provtagningsmedium sÄ att ett visst antal inklusioner, exempelvis 5 per x10 synfÀlt, ses vid upprepade provsÀttningar. Om större avvikelser upptrÀder mellan olika analystillfÀllen, inklusive om inga inklusioner ses, byts positiv kontroll och/eller McCoy celler och orsak till avvikelsen klarlÀggs. Byte av McCoy celler, oavsett utfall av ovanstÄende kontroller, rekommenderas efter 6-8 veckor.


”Blind passage”

Prov som Ă€r negativa vid ovanstĂ„ende fĂ€rgning: Plattorna inkuberas ytterligare 1 dygn, dvs sammanlagt 3 dygn. Medium hĂ€lls av och 0,5 mL provtagningsmedium sĂ€tts till den inokulerade icke fĂ€rgade brunnen för varje negativt prov. Cellerna skrapas loss med en pasteurpipett och förs över till en ny brunn med McCoy-celler. 0,5 mL cellodlingsmedium tillsĂ€tts. DĂ€refter inkuberas och fĂ€rgas cellerna som ovan. Genom denna ”blinda passage” kan sensitiviteten av odlingen ökas.

Referenser

  • 1. Ripa, KT och MĂ„rdh, P-A. Cultivation of Chlamydia trachomatis in cycloheximid-reated McCoy cells. J Clin MIcrobiol 1977, 6:323-331.
  • 2. Stamm, WE et al. Detection of Chlamydia trachomatis inclusions in McCoy cell cultures with fluroescein-conjugated monoclonal antibodies. J Clin Microbiol 1983, 17:666-668.