Laboratoriediagnostik av Vibrio cholerae och övriga anmälningspliktiga Vibrio spp

Artikel uppdaterad maj 2012

---

Huvudartikel: Vibrio cholerae och övriga anmälningspliktiga Vibrio spp

---

Laboratoriediagnostik av Vibrio cholerae och övriga anmälningspliktiga Vibrio spp

Arbete med CTX-producerande Vibrio cholerae vid ett bakteriologiskt laboratorium är förenat med liten smittrisk.

Referensmetodik

Referenssubstrat

Följande substrat utgör referenssubstrat vid primär isolering av Vibrio cholerae

• Alkaliskt peptonvatten
• Blodagar
• Tiosulfat-citrat-galla-sucrose (TCBS) agar

För beskrivning av substraten se Bilaga 1. Bakteriologiska referenssubstrat

Utvärdering av vilka fabrikat och vilka batcher av dessa substrat som är mest optimala för koleradiagnostik saknas. Något speciellt substrat kan därför inte rekommenderas.

Vid ett korrekt taget och korrekt transporterat fecesprov från akut sjukdomsfas då ca 10$^{7}$ till 10$^{8}$ bakterier utsöndras per mL torde dock samtliga fabrikat kunna användas.

Isolering

• Primär utodling: Provmaterialet på provtagningspinne stryks på TCBS-agar och blodagar och sekundärstryk utförs som beskrivs i anvisningarna under utodling. Plattor inkuberas i 37 °C över natt.
• Anrikning: Provtagningspinnen stoppas ned i röret innehållande alkaliskt peptonvatten. Röret inkuberas i 4 - 6 timmar eller över natt varefter pinnen stryks ut på en TCBS-platta och en blodplatta vilka inkuberas över natt. Tid kan sparas om peptonvattnet inkuberas med feces bedside.

Identifiering och minimikriterier

Alla patogena species inom släktet Vibrio utom Vibrio hollisae, växer på TCBS men alla jäser inte sackaros och bildar därför inte gulfärgade kolonier. TCBS är därför rekommenderat substrat för isolering av Vibrio species. Vibrio cholerae växer med karakteristiskt stora, släta, gula kolonier på TCBS.

Misstänkta kolonier plockas och identifieras med biokemiska tester enligt Tabell 19 samt renstryks på blodagar. Testbatteri och plattor inkuberas i 35 °C - 37 °C över natt och avläses. Oxidastest kan inte göras på bakterier som vuxit på TCBS utan görs istället med kolonier som vuxit på blodagar.

För att öka möjligheten att hitta vibriobakterier utan specifik frågeställning kan en blodplatta användas parallellt vid primär utodling. Efter utväxt flödas plattan med oxidasreagens. Misstänkta kolonier plockas och identifieras enligt ovan.

Stammar som är gula på TCBS-agarn (=sackarosjäsare), som är oxidaspositiva och som "jäser" enligt Tabell 19 kan med stor sannolikhet identifieras som Vibrio cholerae. Testerna är samma som används vid diagnostik av övriga tarmpatogena enterobakterier. Konfirmerande identifiering kan erhållas med en kommersiell testbricka, t.ex. API 20E.

Tabell 19. Utfall av referenstester för diagnostik av Vibrio spp

Bakterie	Mannit	LD	OD	H2S	ONPG	Indol	Urea	Oxidas	Sackaros
V. alginolyticus	+/0 gas	+	+	+?	-	+	-	+	+
V. cholerae	+/0 gas	+	+	-	+	+	-	+	+
V. parahaemolyticus	+/0 gas	+	+	-	-	-	-	+	-
V. vulnificus	v/0 gas	+	+	+?	+	+	-	+	-

v: variabel reaktion

För att ställa diagnosen kolera krävs i första hand att stammen agglutinerar i Vibrio cholerae O1 eller O139 antiserum men inte i koksalt. Vidare krävs att toxinproduktion påvisas. Referensmetod för toxin är PCR för påvisande av ctxA-gen. Påvisande av tcpA-genen med PCR konfirmerar att isolatet har förmåga att orsaka kolera. Denna PCR skiljer också på klassisk kolera och El Tor. Metodik har här inte föreslagits för att skilja mellan olika serovarianter inom O1. Sådan information anses ur svenskt perspektiv och i nuvarande läge sakna värde för handläggningen, såväl för patienten som för eventuell epidemiologisk övervakning.

Identifiering av arter inom genus Vibrio kräver kompletterande biokemiska tester och natriumklorid måste ofta tillsättas substraten för att bakterierna skall växa. För verifiering av dessa arter kan kommersiella testbrickor användas. API20NE kan med fördel användas för diagnostik av Vibrio species. Om känslighet och/eller diskriminerande förmåga inte är tillräcklig hänvisas till metodik beskriven i Bergeys Manual of Determinative Bacteriology eller ASM's Manual of Clinical Microbiology alternativt sänds stammen till referenslaboratorium.

• Maldi-Tof: Inom genus Vibrio erhålls species nivå i flertalet fall och med ett fåtal felidentifieringar.

Alternativ diagnostik

• PCR-baserad diagnostik bl.a. riktad mot genen för 16S rRNA kan användas istället för det traditionella biokemiska identifieringsförfarandet. Identifiering av serogrupp O1 och O139 kan utföras med PCR istället för traditionell agglutination.

• Mörkfältsmikroskopi på feces kräver stor vana och kan därför anses vara mindre tillförlitlig.
• Påvisande av toxinproduktion med immunologisk metodik eller med GM1 ELISA kan ersätta PCR förutsatt att metoden är validerad.

Epidemiologisk typning

Epidemiologisk typning kan göras med PFGE. För V. cholerae O1 används också MLVA.

Kvalitetskontroll

• Referensstammar
  • Vibrio cholerae O1 CCUG 9119
  • Vibrio cholerae O139 CCUG 34708
  • Vibrio parahaemolyticus CCUG 51447
• Referensserum Polyvalent O1 Denka Seiken O139 Denka Seiken

Svarsrutiner

För Vibrio cholerae kan följande svarsalternativ användas:

Då minimikriterierna är uppfyllda svaras: "Växt av toxinproducerande Vibrio cholerae O1 alt. O139."

Icke toxinbildande varianter besvaras: "Växt av Vibrio cholerae O1 alt. O139, ej toxinbildande. Stammen orsakar inte kolera"

Fynd av Vibrio cholerae vilka inte agglutinerar svaras: "Växt av Vibrio cholerae non-O1/O139. Stammen orsakar inte kolera "

Har toxintesten på en non-O1 utfallit positiv svaras: "Växt av koleratoxinproducerande Vibrio cholerae non-O1/O139. Stammen orsakar inte kolera "

Laboratorierapportering

Enligt gällande falldefinitioner kolera och Vibrioinfektion (exkl. kolera)