PAR 02 Ziehl-Neelsen fÀrgning

Hoppa till: navigering, sök

Huvudartikel, reviderad i mars 2013.


Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik:Parasitologisk diagnostik och Tarminfektioner



Mikroskopisk pÄvisning av Cryptosporidium, Cyclospora och Isospora- oocystor efter modifierad Ziehl-Neelsen-fÀrgning.

Analysprincip

Mikroskopisk pÄvisning av syrafasta organismer. Provmaterialet droppas/stryks ut pÄ objektglas som lufttorkas, fixeras i metanol, infÀrgas med karbolfuksin, avfÀrgas med saltsyra i etanol och bakgrundsfÀrgas med malakitgrönt. Oocystorna fÀrgas röda mot en grön bakgrund.

Speciell utrustning

Ljusmikroskop med objektiv 40x, 50x, 100x samt kalibrerat mÀtokular

Reagens

  • metanol 99.8 % CH3OH p.a.
  • karbolfuksinlösning
Alternativ I: fÀrdigberedd karbolfuksinlösning (exempelvis Tbcolor frÄn Merck)
Alternativ II: karbolfuksinlösning enligt referens 1
basiskt fuksin 10 g
etanol 99,5% 100 mL
fenol 50 g
destillerat vatten 1000 mL
Lös 10 g basiskt fuksin i 100 mL etanol. AnvÀnd en flaska som rymmer minst 1500 mL. VÀg upp 50 g fenol i en bÀgare och lös i en del av vattnet. Blanda alltsammans i flaskan. SÀtt till resten av vattnet och blanda pÄ nytt. Observera att fenol Àr toxiskt och frÀtande.
  • saltsyra i etanol (avfĂ€rgningslösning för Ziehl-Neelsen)
Blanda 10 mL konc HCl med 990 mL 95 % etanol.
  • malakitgrönt 1 %
Lös 1 g malakitgrönt i 100 mL destillerat vatten.
  • positiv kontroll Cryptosporidium

Formalinfixerat fecesprov med Cryptosporidium-oocystor
  • immersionsolja för ljusmikroskop

Analysprocedur

Förbehandling av prover

FÀrgningen utförs i regel pÄ koncentrerad feces. För koncentrering av feces se metodbeskrivning PAR 01. Fecesprover som innehÄller rikligt med slem fÀrgas Àven okoncentrerade.

FĂ€rgningsprocedur

Positiv kontroll skall ingÄ i varje fÀrgningsomgÄng.

1. MÀrk objektglasets mattfÀlt med labnummer.

2. Stryk ut ca 20 ”L av provmaterialet pÄ objektglaset. Gör preparatet ca 15 mm i diameter.

3. LÄt preparatet lufttorka till det Àr absolut torrt (ca 60 min i rumstemperatur).

4. Fixera glaset 5 min i metanol i glaskyvett med lock.

5. LÀgg glaset pÄ fÀrgstÀllet och tÀck med karbolfuksin. FÀrga 20 min. Se anmÀrkning nedan.

6. Skölj under rikligt med rinnande kranvatten.

7. AvfÀrga ett glas i taget med avfÀrgningslösning (saltsyra i etanol) tills den röda fÀrgen Àr borta.

8. Skölj under rikligt med rinnande kranvatten.

9. TĂ€ck glaset med 1 % malakitgrönt i 3 min. Se anmĂ€rkning nedan.

10. Skölj under rikligt med rinnande kranvatten.

11. LĂ„t preparatet torka.

12. Montera eventuellt med DPX eller annat permanent monteringsmedium och tÀckglas (ger hÄllbarare preparat). LÄt torka.

AnmÀrkning

FÀrgningstider för karbolfuksinlösning och malakitgrönt varierar mellan olika publikationer. Bör utprovas lokalt.

AvlÀsning

Granska hela preparatet. AnvÀnd 40x (förutsÀtter monterat preparat) eller 50x immersionsobjektiv för översiktsgranskning och 100x immersionsobjektiv för verifiering. MÀt storleken pÄ eventuella oocystor med mÀtokular. För morfologiska kriterier av olika oocystor se under respektive parasit-avsnitt.

KvalitetssÀkring

Intern

Positiv kontroll: Fecesprov med kÀnt innehÄll av formaldehyd- eller SAF-fixerade Cryptosporidium-oocystor. Förvaras i kylskÄp och behandlas som övriga prover. Lokal panel innehÄllande Ziehl-Nelesen-fÀrgade oocystor (Cryptosporidium spp, Cyclospora cayetanensis och Isospora belli). För bildmaterial se referens 4 och 5.

Extern

Oocystor ingÄr i UK-NEQAS feces-utskick

Svarsrutiner

Negativt prov: Inga oocystor pÄvisade

Positivt prov: T.ex. Oocystor av Cryptosporidium spp pÄvisade

SĂ€kerhetsaspekter

Iaktta försiktighet vid arbete med ej avdödat provmaterial. Behandling med 3,7 % formaldehyd under 30 min avdödar Cryptosporidium-oocystor.

Referenser

1. Cheesbrough M. Medical Laboratory Manual for Tropical Countries. Volume I. Tropical Health Technology Butterworths 1987, 216-218.

2. Gillespie SH, Hawkey PM. Medical Parasitology. IRL Press 1995, 96-97.

3: UK-NEQAS Modified Ziehl_Neelsen http://www.btinternet.com/~ukneqas.parasitologyscheme/Faecal_Scheme/Teaching_Information/Diagnostic_procedures/Permanent_stains/permanent_stains.html

4. WHO 1994. Bench Aids for the Diagnosis of Intestinal Parasites. Plate 9 Intestinal coccidians and microspora.

5. Ash L, Orihel T. Atlas of Human Parasitology. ASCP Press, Chicago.