PAR 08 Mikroskopisk pÄvisning av mikrofilarier i blod

Hoppa till: navigering, sök

Huvudartikel, publicerad mars 2012.


Till innehÄllsförteckngen för Referensmetodik:Parasitologisk diagnostik


Mikroskopisk pÄvisning av mikrofilarier i blod

Analysprincip

Direktmikroskopi: helblod undersöks direkt för levande mikrofilarier.

Membranfiltrering: helblod filtreras genom ett filter med porstorlek 3 ”m. Filtret Giemsa-fÀrgas och undersöks i ljusmikroskop. Metoden ger ökad detektionsnivÄn och tillÄter kvantifiering av mikrofilarier. ArtbestÀmning kan försvÄras pÄ grund av otydlig morfologi.

Knotts koncentration: helblod blandat med 2 % formalin centrifugeras och sedimentet undersöks i ljusmikroskop efter Giemsa- fĂ€rgning. Röda blodkroppar hemolyseras medan vita blodkroppar och mikrofilarier koncentreras. Metoden ökar detektionsnivĂ„n av mikrofilarier i blod och tillĂ„ter artbestĂ€mning.

Provmaterial

  • EDTA-blod. Blod utan tillsats av antikoagulantia kan inte anvĂ€ndas. Rekommenderad provvolym Ă€r 2 x 5 mL; minst 3 mL blod för membranfiltrering plus 1 mL för Knotts koncentration.

Speciell utrustning

  • mikroskop med kalibrerat mĂ€tokular och objektiv 20x alt 25x, 40x, 100x
  • filterhĂ„llare
  • filter (3 ”m porstorlek)

Analysprocedur

Direktmikroskopi

Blanda om blodet och lÀgg en droppe blod pÄ objektglas och lÀgg pÄ tÀckglas. Granska i ljusmikroskop med objektiv 10x för levande mikrofilarier. Om provet Àr positivt kan artbestÀmning göras efter fÀrgning av tjock droppe och utstryk. Om provet Àr negativt eller om kvantifiering av mikrofilarier önskas fortsÀtt med membranfiltrering.

Membranfiltrering

OBS! AnvÀnd inte allt blod till membranfiltrering. Vid positivt fynd görs Knotts koncentration. Arbeta i dragskÄp (punkt 1-8). AnvÀnd handskar.

  1. MĂ€rk ett objektglas med provnummer.
  2. Ta upp ett filter (3 ”m porstorlek) med pincett. BlötlĂ€gg filtret i en bĂ€gare med 0,9 % NaCl tillsammans med filterhĂ„llarens vita packning. LĂ€gg det vĂ„ta filtret mitt pĂ„ filterhĂ„llarens underdel. LĂ€gg packningen ovanpĂ„ och skruva fast överdelen. OBS! Viktigt att filtret inte kommer snett!
  3. Dra ur pistongen ur sprutan. Koppla ihop sprutan med filterhÄllaren. Pipettera minst 3 mL vÀlblandat blod i sprutan. Tryck ner pistongen och spruta blodet genom filtret. Filtratet samlas upp i slaskflaskan. Lossa sprutan frÄn filterhÄllaren innan pistongen dras upp.
  4. Spruta igenom filtret 3 x 10 mL 0,9 % NaCl.
  5. Spruta igenom 10 mL luft. OBS! FortsĂ€tt enligt punkterna 6-13 om filtret ska fixeras och Giemsa-fĂ€rgas. För att observera levande, rörliga mikrofilarier följ beskrivningen under ”AnmĂ€rkning”.
  6. Spruta igenom 5 mL metanol.
  7. Spruta igenom 5 mL luft.
  8. Skruva isÀr filterhÄllaren. LÀgg filtret rÀttvÀnt pÄ objektglaset, dvs. med provmaterialet uppÄt.
  9. LĂ„t torka.
  10. FĂ€rga 20 min med 5 % Giemsalösning i fosfatbuffert pH 7,2. För spĂ€dning av GiemsafĂ€rg se metodbeskrivning (PAR 09)
  11. Skölj filtret försiktigt i en bÀgare med kranvatten. HÄll fast filtret mot glaset med en pincett.
  12. LĂ„t torka.
  13. Montera filtret med monteringsmedium och pressa försiktigt bort eventuella luftbubblor. LÄt torka innan avlÀsning.
AnmÀrkning
Observeration av levande, rörliga mikrofilarier.
  • Skruva isĂ€r filterhĂ„llaren. LĂ€gg filtret rĂ€ttvĂ€nt pĂ„ objektglaset, dvs. med provmaterialet uppĂ„t.
  • LĂ€gg till en droppe 0,9 % NaCl, lĂ€gg pĂ„ tĂ€ckglas. Granska i mikroskop med 10x och 20x objektiv. Vid positivt fynd gör Giemsa-fĂ€rgning enligt följande:
  • LĂ„t glaset torka.
  • Fixera i metanol i 3 min.
  • FĂ€rga filter med Giemsa-fĂ€rg enligt punkterna 10 -13.
AvlÀsning

Granska filtret i ljusmikroskop med objektiv 20x alternativt 25x. AnvÀnd objektiv 40x för verifiering av positiva fynd. Vid positivt fynd rÀknas antalet mikrofilarier.

Knotts koncentration (ref. 5 och 6)

Arbeta i dragskÄp (punkt 1-7). AnvÀnd handskar.

  1. MĂ€rk minst 3 objektglas med provnummer samt datum.
  2. Blanda 9 mL 2 % formalin med 1 mL blod i ett 10 mL-rör.
  3. Centrifugera 500 x g i 10 minuter.
  4. För över supernatanten till en kastburk med en plastpipett. Sedimentet bestÄr av vita blodkroppar och eventuella mikrofilarier.
  5. MÀt volymen av sedimentet med en pipett sÄ att koncentrationen av mikrofilarier kan berÀknas.
  6. Pipettera sedan flera 50 ”L droppar av sedimentet pÄ varje objektglas tills sedimentet tar slut. OBS! AnvÀnd allt sediment. LÄt glasen lufttorka i minst 60 minuter och fixera sedan materialet 30 sekunder i metanol innan Giemsa-fÀrgning.
  7. FĂ€rga preparaten 20 min med 5 % Giemsalösning i fosfatbuffert pH 7,2. För spĂ€dning av Giemsa se metodbeskrivning (PAR 09).
AvlÀsning

Granska preparaten i ljusmikroskop med objektiv 20x. AnvÀnd objektiv 40x och 100x för verifiering. För fÀrgbarhet, storlek och övriga karakteristika av mikrofilarier se referenser 2 och 3. RÀkna antal mikrofilarier i sedimentet.

KvalitetssÀkring

Intern För bildmaterial se referenser 2 och 3. Intern panel med sparade positiva preparat samt preparat frÄn UK-NEQAS.

Extern Mikrofilarier ingÄr i UK-NEQAS-blodutskick.

Kommentar

Membranfiltrering och Knotts koncentration

Sensitiviteten Ă€r hög jĂ€mfört med tjock droppe/utstryk. Enstaka mikrofilarier per mL helblod kan detekteras. Specificiteten Ă€r 100 %. Mikrofilarier Ă€r inte rörliga med Knotts koncentration eftersom 2 % formalin dödar dem.

Svarsrutiner

Mikrofilarier pÄvisade (ange genus och art). Ange antal mikrofilarier och blodvolym.

Mikrofilarier inte pÄvisade.

SÀkerhet och miljöaspekter

Se malariamikroskopi (PAR 09)

LitteraturhÀnvisningar

1. Dennis DT, Kean BH. Isolation of microfilariae. Report of a new method. J Parasitol. 1971, 57:1146-47.

2. Ash L, Orihel C. Atlas of Human Parasitology. ASCP Press, Chicago.

3. WHO. Bench Aids for the Diagnosis of Filarial infections.

4. Garcia L. Diagnostic Medical Parasitology. American Society for Microbiology Press, Washington D.C.

5. http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/Filariasis.htm

6. Markell EK, Voge M. Medical Parasitology. 5:e ed, WB Saunders Company, Philadelphia, 1981.