Skillnad mellan versioner av "Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA)"
(Skapade sidan med '''Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Molekylärbiologisk diagnostik'' ---- == Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA) == '''NASBA''' är en av a…') |
|||
| (En mellanliggande sidversion av samma användare visas inte) | |||
| Rad 7: | Rad 7: | ||
'''NASBA''' är en av amplifieringsmetoderna som är baserade på transkription ('''figur 17'''). Andra transkriptionsbaserade amplifieringssystem är bland annat Transcription Mediated Amplification (TMA), Transcription-based amplification system (TAS) och Self-sustained sequence replication (3SR). Kommersiella metoder baserade på denna process används för detektion av ''[[Chlamydia trachomatis]], [[Neisseria gonorrhoeae]]'' och ''[[Mycobacterium tuberculosis]]'' [http://www.gen-probe.com Gen-probe] samt för detektion av onkoprotein E6/E7 mRNA-uttryck från högrisk HPV [http://www.norchip.no Norchip]. Templatet är vanligtvis RNA och metoden baseras på kopiering av RNA-målsekvensen med hjälp av tre olika enzymer; ''reverse transkriptas'', ''RNaseH'' och ''T7 DNA-beroende RNA-polymeras''. Metoden är isotermal, mycket snabb och ger mycket stora kopietal av målsekvensen. Mål-RNA kopieras först med enzymet reverse transkriptas till en DNA-molekyl som då bildar en RNA:DNA-hybrid. Enzymet RNaseH bryter ned RNA i denna hybrid som då innehåller endast cDNA. Många RNA-kopior kan då produceras, transkriberas, av enzymet T7 DNA-beroende RNA-polymeras från detta cDNA. Målsekvensen detekteras med en probe inmärkt med en fluorofor och en släckare/quencher, en molecular beacon probe (se [[Realtids-PCR]]). Ökningen av fluorescens i provet detekteras i en fluorescensläsare och analyseras. Risken för kontamination är mindre med system baserade på RNA-kopiering än DNA-kopiering, då RNA kopiorna som produceras inte är lika stabila som amplifierat DNA. | '''NASBA''' är en av amplifieringsmetoderna som är baserade på transkription ('''figur 17'''). Andra transkriptionsbaserade amplifieringssystem är bland annat Transcription Mediated Amplification (TMA), Transcription-based amplification system (TAS) och Self-sustained sequence replication (3SR). Kommersiella metoder baserade på denna process används för detektion av ''[[Chlamydia trachomatis]], [[Neisseria gonorrhoeae]]'' och ''[[Mycobacterium tuberculosis]]'' [http://www.gen-probe.com Gen-probe] samt för detektion av onkoprotein E6/E7 mRNA-uttryck från högrisk HPV [http://www.norchip.no Norchip]. Templatet är vanligtvis RNA och metoden baseras på kopiering av RNA-målsekvensen med hjälp av tre olika enzymer; ''reverse transkriptas'', ''RNaseH'' och ''T7 DNA-beroende RNA-polymeras''. Metoden är isotermal, mycket snabb och ger mycket stora kopietal av målsekvensen. Mål-RNA kopieras först med enzymet reverse transkriptas till en DNA-molekyl som då bildar en RNA:DNA-hybrid. Enzymet RNaseH bryter ned RNA i denna hybrid som då innehåller endast cDNA. Många RNA-kopior kan då produceras, transkriberas, av enzymet T7 DNA-beroende RNA-polymeras från detta cDNA. Målsekvensen detekteras med en probe inmärkt med en fluorofor och en släckare/quencher, en molecular beacon probe (se [[Realtids-PCR]]). Ökningen av fluorescens i provet detekteras i en fluorescensläsare och analyseras. Risken för kontamination är mindre med system baserade på RNA-kopiering än DNA-kopiering, då RNA kopiorna som produceras inte är lika stabila som amplifierat DNA. | ||
| + | |||
'''Figur 17.''' NASBA reaktionen. Bild; ''Technology Real Time NASBA, Copyright NorChip,'' [http://www.norchip.no] | '''Figur 17.''' NASBA reaktionen. Bild; ''Technology Real Time NASBA, Copyright NorChip,'' [http://www.norchip.no] | ||
| + | [[Fil:molekylfig17A.jpg|thumb|left|500px|NASBA reaktionen startar då primern (P1) hybridiserar till mål-RNAt. Primern innehåller en 5’-terminal T7 RNA polymeras promotor sekvens. Reverse transkriptas förlänger primern, bildar en cDNA-kopia av RNA-templatet som sedan formar en DNA/RNA-hybrid.]] | ||
| + | [[Fil:molekylfig17B.jpg|thumb|left|500px||| | ||
| + | RNase H känner igen hybriden som substrat och hydrolyserar, bryter ned, RNA-delen av hybriden vilket resulterar i enkelsträngat DNA. Den andra primern (P2) binder till detta DNA. Reverse transkriptas (RT) förlänger primer P2 vilket gör promotorregionen på DNA-molekylen dubbelsträngad och transkriptionellt aktivt.]] | ||
| + | [[Fil:molekylfig17C.jpg|thumb|left|500px||| | ||
| + | RNA polymeras känner igen den nu funktionella promotorn och startar produktionen av stora mängder RNA transkript som är antisense mot den ursprungliga mål-RNA-sekvensen.]] | ||
| − | + | ||
| − | |||
| − | |||
[[Kategori:Molekylärbiologisk diagnostik]] | [[Kategori:Molekylärbiologisk diagnostik]] | ||
Nuvarande version från 4 september 2010 kl. 16.08
Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Molekylärbiologisk diagnostik
Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA)[redigera]
NASBA är en av amplifieringsmetoderna som är baserade på transkription (figur 17). Andra transkriptionsbaserade amplifieringssystem är bland annat Transcription Mediated Amplification (TMA), Transcription-based amplification system (TAS) och Self-sustained sequence replication (3SR). Kommersiella metoder baserade på denna process används för detektion av Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae och Mycobacterium tuberculosis Gen-probe samt för detektion av onkoprotein E6/E7 mRNA-uttryck från högrisk HPV Norchip. Templatet är vanligtvis RNA och metoden baseras på kopiering av RNA-målsekvensen med hjälp av tre olika enzymer; reverse transkriptas, RNaseH och T7 DNA-beroende RNA-polymeras. Metoden är isotermal, mycket snabb och ger mycket stora kopietal av målsekvensen. Mål-RNA kopieras först med enzymet reverse transkriptas till en DNA-molekyl som då bildar en RNA:DNA-hybrid. Enzymet RNaseH bryter ned RNA i denna hybrid som då innehåller endast cDNA. Många RNA-kopior kan då produceras, transkriberas, av enzymet T7 DNA-beroende RNA-polymeras från detta cDNA. Målsekvensen detekteras med en probe inmärkt med en fluorofor och en släckare/quencher, en molecular beacon probe (se Realtids-PCR). Ökningen av fluorescens i provet detekteras i en fluorescensläsare och analyseras. Risken för kontamination är mindre med system baserade på RNA-kopiering än DNA-kopiering, då RNA kopiorna som produceras inte är lika stabila som amplifierat DNA.
Figur 17. NASBA reaktionen. Bild; Technology Real Time NASBA, Copyright NorChip, [1]
