Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA)
Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Molekylärbiologisk diagnostik
Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA)
NASBA är en av amplifieringsmetoderna som är baserade på transkription (figur 17). Andra transkriptionsbaserade amplifieringssystem är bland annat Transcription Mediated Amplification (TMA), Transcription-based amplification system (TAS) och Self-sustained sequence replication (3SR). Kommersiella metoder baserade på denna process används för detektion av Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae och Mycobacterium tuberculosis Gen-probe samt för detektion av onkoprotein E6/E7 mRNA-uttryck från högrisk HPV Norchip. Templatet är vanligtvis RNA och metoden baseras på kopiering av RNA-målsekvensen med hjälp av tre olika enzymer; reverse transkriptas, RNaseH och T7 DNA-beroende RNA-polymeras. Metoden är isotermal, mycket snabb och ger mycket stora kopietal av målsekvensen. Mål-RNA kopieras först med enzymet reverse transkriptas till en DNA-molekyl som då bildar en RNA:DNA-hybrid. Enzymet RNaseH bryter ned RNA i denna hybrid som då innehåller endast cDNA. Många RNA-kopior kan då produceras, transkriberas, av enzymet T7 DNA-beroende RNA-polymeras från detta cDNA. Målsekvensen detekteras med en probe inmärkt med en fluorofor och en släckare/quencher, en molecular beacon probe (se Realtids-PCR). Ökningen av fluorescens i provet detekteras i en fluorescensläsare och analyseras. Risken för kontamination är mindre med system baserade på RNA-kopiering än DNA-kopiering, då RNA kopiorna som produceras inte är lika stabila som amplifierat DNA.
Figur 17. NASBA reaktionen. Bild; Technology Real Time NASBA, Copyright NorChip, [1]
NASBA reaktionen startar då primern (P1) hybridiserar till mål-RNAt. Primern innehåller en 5’-terminal T7 RNA polymeras promotor sekvens. Reverse transkriptas förlänger primern, bildar en cDNA-kopia av RNA-templatet som sedan formar en DNA/RNA-hybrid.
RNase H känner igen hybriden som substrat och hydrolyserar, bryter ned, RNA-delen av hybriden vilket resulterar i enkelsträngat DNA. Den andra primern (P2) binder till detta DNA. Reverse transkriptas (RT) förlänger primer P2 vilket gör promotorregionen på DNA-molekylen dubbelsträngad och transkriptionellt aktivt.
RNA polymeras känner igen den nu funktionella promotorn och startar produktionen av stora mängder RNA transkript som är antisense mot den ursprungliga mål-RNA-sekvensen.