Urin-bilaga 1

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Urinvägsinfektioner/bakteriuri, 2:a upplagan 2000

Substratrecept

Urvalet av referenssubstrat i denna gula bok har följt principen att finna medier som effektivast möjligt understödjer växt av beskrivna mikroorganismer. Alla laboratorier måste inte nödvändigtvis använda just dessa substrat, även om det genom inventerande EQUAS-utskick kan konstateras att så sker i många fall. De enskilda laboratoriernas substratval följer traditioner baserade på lokala erfarenheter, kunskaper och uppfattningar. Tanken är att referenssubstraten därvid skall utgöra valideringsgrund vid det lokala substratvalet. Ett problem vid sådana valsituationer är att olika fabrikat av ett substrat med synbarligen samma recept (eller olika recept för den delen) kan ha olika egenskaper och fungera mer eller mindre väl. Betydande batchvariationer förekommer också. Det är alltså lämpligt att t ex. inför en upphandling jämföra angivet referenssubstrat mot en uppsättning av alternativa substrat där det förra inte nödvändigtvis är det som visar sig ha de bästa egenskaperna.

För referenssubstraten anges firmanamn och katalognummer för spårbarhet till typrecept.

Näringsberikade fasta substrat för isolering av aeroba och fakultativt anaeroba bakterier (blodagar, hematinagar och CLED-agar)

Till blod- och hematinagar används specialkomponerade blodagarbaser som finns kommersiellt tillgängliga. I dessa ingår ofta skonsamt enzymdigererat kasein som tillhandahåller peptider och aminosyror med lågt kolhydratinnehåll och bibehållen hög halt av tryptofan. Det senare möjliggör test av indolreaktion. Extrakt av köttprotein ger ytterligare aminosyror, vitaminer, spårelement etc. Dessa komponenter är definierade i US Pharmacopeia. Tillsatt autolysat av bakjäst bidrar till snabb tillväxt och ger substraten goda differentierande egenskaper. Majsstärkelse absorberar toxiska metaboliter inklusive fria fettsyror vilket bidrar till säker tillväxt. Ett generellt problem med blodagarbaser är det relativt höga innehållet av reducerande kolhydrater vilket negativt påverkar den hemolytiska kapaciteten hos betastreptokocker. Columbia blodagarbas enligt Ellner et al (1966) är speciellt komponerad för snabb tillväxt och differentiering och relationen mellan ingående peptoner har avvägts så att streptokockernas förmåga att producera betahemolysin optimerats. Columbia blodagarbas är därför lämplig som referensbas för blodagar.

Columbiablodagarbas och Blodagarbas II kan användas som bas för hematinagar (chokladiserad blodagar) avsedd att understödja växt också av Haemophilus- och Neisseria-arter. Emellertid utgör traditionellt Carpenter och Johnstons gc-agarbas grundmedium i hematinagar. Denna bas skiljer sig från andra blodagarbaser genom något mindre agarmängd och fosfatbuffring. I kombination med hemoglobin och andra tillväxtfaktorer erhålls ett mycket näringsrikt medium som innehåller bland annat bundet oxiderat hem (hematin, X-faktor) och NAD (V-faktor). Hematinplattor med Gc-agarbas utgör därmed referenssubstrat, vilka också, till skillnad från andra hematinagartyper kan användas för resistensbestämning av gonokocker.

1. Blodagar

Indikation: Substrat anrikat med hästblod för isolering av ett stort antal typer av aeroba och fakultativt anaeroba mikroorganismer samt olika gramnegativa stavar, Neisseria (ej gonokocker), stafylokocker, pneumokocker och streptokocker från kliniska prov.

Princip: Columbia blodagarbas är ett välkomponerat grundmedium med bland annat kaseinhydrolysat och köttextrakt som kväve- och kolhydratkällor avsett att användas anrikat med 5-10 % valfritt blod. Vanligen används 5 % defibrinerat hästblod vilket ger distinkt betahemolys med olika streptokocker, vissa stammar av enterokocker och Listeria. Defibrinerat hästblod har ringa tendens att chelera metalljoner och ger ofta frodigare kolonier än om citratblod används. Många fabrikat av Columbia blodagarbas är inte avpassade för citratblod vilket också gäller referenssubstratet. Betahemolys orsakas av hemolys av de röda blodkropparna medan alfahemolys orsakas av att hemoglobinet i helt eller delvis intakta röda blodkroppar reduceras till methemoglobin. För blodagar avsedd för påvisande av betastreptokocker i svalgodlingar brukar istället 5-10 % fårblod rekommenderas, eftersom exempelvis enterokocker ofta inte ger betahemolys på sådant blod. Fårblod tenderar också att undertrycka normalflora, särskilt Haemophilus, mer än hästblod. Fårblodplattor kan gjutas dubbelskiktade för att underlätta avläsningen.

Växtkarakteristika: (se tabell 14).

På hästblodagar växer de flesta bakteriearter ut inom ett dygn. Kolonistorlek och utseende varierar kraftigt mellan olika arter trots att mediet inte i klassisk bemär¬kelse är differentierande. Flera bakteriearter uppvisar alfa- eller betahemolys, den senare med större säkerhet om plattorna inkuberas anaerobt. Ett flertal bakterietyper växer svagt eller inte alls på hästblodagar. Dit hör bland andra Haemophilus influenzae, Legionella och gonokocker.

Recept: (Columbia blodagarbas, Acumedia no 7125)
- Innehåll---- Gram/L
- Pankreasdigererat kasein---- 5,0
- Köttextrakt---- 8,0
- Jästanrikad pepton--- 10,0
- Majsstärkelse---- 1,0
- NaCl---- 5,0
- Agar---- 14,0

pH 7,3 ± 0,2 vid 25 °C

Bered 5 % blodagar genom tillsats av sterilt, defibrinerat hästblod (alternativt fårblod, humanblod) enligt tillverkarens anvisningar.

2. Hematinagar (Chokladiserad blodagar)

Indikation: Näringsberikat medium för isolering av gonokocker, meningokocker och Haemophilus influenzae från kliniska prov. Resistensbestämning av gonokocker.

Princip: Gc-agarbasbaserat medium som näringsberikas antingen med hemoglobin (torkat nötblod) och Isovitalex eller med hemolyserat hästblod och hästserum. Gc-agarbas utnyttjar som många andra blodagarbaser kaseinhydrolysat och köttextrakt som kväve- och kolhydratkälla. Reducerad agarmängd och fosfatbuffring bidrar till bättre och snabbare växt av framförallt gonokocker. Hemoglobin och Isovitalex (liksom lyserat hästblod och serum) tillför mediet bland annat X-faktor och V-faktor, en förutsättning för växt av H. influenzae, men bidrar också till god växt av Neisseria-arter. Hematinagar används också med tillsats av selekterande antibiotika (Modifierad Thayer-Martin-agar, VCNT-supplement) för isolering av gonokocker från kliniska prov.

Växtkarakteristika: (se tabell 14).

Meningokocker, gonokocker och Haemophilus växer inom ett dygn med ”feta” blanka gråa kolonier, 0,5-2 mm. På hematinagar växer också inom ett dygn (ofta med kraftigare växt efter två dygn) pneumokocker och streptokocker med tydlig alfahemolys (gäller inte t.ex. GBS), stafylokocker (vita eller gulgråa kolonier), Listeria (stora matta platta kolonier) och ett flertal arter av gramnegativa stavar (stora ofta ”råa” kolonier). Candida albicans växer inom ett till två dygn med karakteristiskt ”stjärn-” formade vita, matta kolonier.

Recept: (Gc-agarbas, Acumedia no 7104)
- Innehåll---- Gram/L
- Pankreasdigererat kasein---- 7,5
- Köttextrakt---- 7,5
- Majsstärkelse---- 1,0
- Di-kaliumfosfat---- 4,0
- Mono-kaliumfosfat---- 1,0
- NaCl---- 5,0
- Agar---- 10,0

pH 7,2 ± 0,2 vid 25 °C

Tillred hematinagar genom tillsats av hemoglobinpulver 10 g och IsoVitaleX 10,0 mL enligt tillverkarens anvisningar.

Recept: IsoVitaleX (BBL, no 11876)

- Innehåll---- Gram/L
- Vitamin B12---- 0,1
- L-glutamin---- 10,0
- Adenin---- 1,0
- Guanin HCl---- 0,03
- p-Aminobensoesyra---- 0,013
- Nikotinamid-adenin-dinukleotid---- 0,25
- Tiamin pyrofosfat---- 0,1
- Järnnitrat---- 0,02
- Tiamin HCl---- 0,003
- L-cystein HCl---- 25,9
- L-cystin----- 1,1
- D-Glukos---- 100,0

3. Andra beredningsformer av blod- och hematinagar

Ovanstående agarmedier utgör referenssubstrat. Dock kan andra beredningsformer förekomma på de enskilda laboratorierna. Det är därvid viktigt att validera dessa substrat mot referenssubstraten.

Blodagar:

Moderna kommersiella blodagarbaser har ofta goda egenskaper och är relativt likvärdiga. Alternativ till Columbia agarbas är Blodagarbas II. Det skall observeras att särskilt betahemolys kan påverkas beroende på vilken bas som väljs. Med Blodagarbas II erhålls utmärkt växt, men betahemolys kan bli odistinkt, dubbel, särskilt med fårblod.

Recept: (Blodagarbas II, OX0ID, CM 271)

- Innehåll---- Gram/L
- Proteos pepton---- 15,0
- Digererad lever---- 2,5
- Jästextrakt---- 5,0
- NaCl---- 5,0
- Agar---- 12,0

pH 7,4 ± 0,2 vid 25 °C

Preparera 5 % blodagar genom tillsats av sterilt defibrinerat hästblod (alternativt fårblod, humanblod) enligt tillverkarens anvisningar.

Hematinagar:

Sådan agar kan tillverkas med vilken blodagarbas som helst. Det skall observeras att endast hematinagar baserad på gc-agarbas lämpar sig för resistensbestämning av gonokocker.

Recept: Hematinagar (alternativ för isolering av H. influenzae och Neisseriae)
- Columbia blodagarbas med tillsats av:
- Hästblod i lösning---- 8,5 %
- Normalserum från häst 5-10 %

Tillverkas med chokladisering av blodet.

4. CLED-agar

Indikation: Referenssubstrat för (i första hand) isolering av urinvägspatogener från urinprov, och Enterobacteriaceae vid allmän odling.

Princip: CLED är en förkortning av Cystein-Lactose-Electrolyt-Deficient utvecklat av Sandys och Mackey. Substratet är ickeinhibitoriskt men inte lika näringsrikt som blodagar. Innehåller såväl kaseinhydrolysat som köttextrakt och understödjer därmed växt av ett stort antal kliniskt relevanta bakterietyper. Karakteristiskt för detta substrat är avsaknaden av elektrolyter, vilket hindrar svärmning i första hand av Proteus. Mindre selektivt men för övrigt funktionellt nära saltfri McConkey-agar. Laktospositiva bakterier blir gula medan laktosnegtativa behåller mediets blåa grundfärg. Kontaminanter från urogenital flora (laktobaciller, mikrokocker och difteroider) växer ofta ut som mikrokolonier på plattan, vilket indikerar förorening.

Växtkarakteristika: (se tabell 14). E. coli och andra gramnegativa bakterier växer inom ett dygn med relativt stora (diameter >2mm), opaka, blanka, släta kolonier. Laktospositiva bakterier blir gulfärgade, ofta med gult färgomslag i substratet. Grampositiva bakterier som stafylokocker och enterokocker växer med mindre, ofta gula kolonier (diameter 1-2mm). Growth index för de flesta bakterietyper nära de för blodagar.

Recept: CLED-agar (enligt Mackey och Sandys, OXOID CM301)
- Innehåll---- Gram/L
- Pepton---- 4,0
- ”Lab-Lemco” pulver---- 3,0
- Trypton---- 4,0
- Laktos---- 10,0
- L-cystein---- 0,128
- Bromtymolblått---- 0,02
- Agar---- 15,0

pH 7,3 ± 0,2 vid 25 °C

5. Kromagar för urindiagnostik (ej referenssubstrat)

Indikation: Medier lämpade för rutindiagnostiska ändamål, i första hand urindiagnostik, där de kan vara alternativ till referenssubstrat (CLED-agar). Används för presumtiv artdiagnostik av vissa kliniskt relevanta bakteriearter, särskilt E. coli, men också för att urskilja olika målbakterier i blandfloror.

Princip: Kromagar för urindiagnostik är komponerade som differentierande, icke selektiva medier för isolering och identifiering av bakterier från kliniska prov. En särskild kromogen mix (påvisar aktivitet av speciesspecifika enzymer) får bakteriekolonierna efter aerob inkubering att framträda med i olika färger. Eftersom färgerna med hög specificitet är relaterade till vissa vanliga bakteriearter kan mediet användas för presumtiv artdiagnostik i rutindiagnostiken enligt laboratoriets rutiner för bakteriediagnostik.

Som exempel anges BD CHROMagar Orientation medium . Enligt tillverkaren skall bakteriekolonier framträda i följande färger

E. coli----- rosa till vinrött (via beta-galaktosidasaktivitet)
Enterokocker----- bågrön
KES (Klebsiella/Serratia/Enterobacter)-----blå till mörkblå
Proteeae----- beige med omgivande brun ring (cirka 50 % av P. vulgaris är blir blåa med brun ring)
S. saprophyticus----- ljusrosa till rosa

Prestanda: Se artikel Kromogena substrat

Recept: BD CHROMagar Orientation medium (Becton Dickinson, Levereras som färdiga hela plattor i Petriskålar (9 cm))

- Innehåll---- Gram/L

- Krompepton---- 16,1

- Kromogen Mix ---- 1,3

- Agar---- 15,

- Renat vatten ------ 1 L

Substratkontroll fasta odlingsmedier för urindiagnostik