Betahemolyserande streptokocker grupp A, B, C och G

Huvudartikel

---

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Övre luftvägsinfektioner (ÖLI)

---

BETAHEMOLYSERANDE STREPTOKOCKER GRUPP A, B, C OCH G - GAS, GBS, GCS OCH GGS

Smittämnet

Som etiologiska agens till övre luftvägsinfektioner inom genus Streptococcus dominerar S. pneumoniae och S. pyogenes (GAS). Även betahemolyserande streptokocker Lancefield grupp C (GCS) och betahemolyserande streptokocker Lancefield grupp G (GGS) är kända patogener framför allt vid faryngotonsillit (15-20 % av odlingspositiva svalgprov). Streptococcus agalactiae (GBS) kan också isoleras vid symtomatisk svalginfektion men dess betydelse är omdiskuterad.

Klassifikationen av streptokocker i vid bemärkelse har undergått omfattande taxonomiskt omvärderingsarbete men fortfarande saknas en klar bild över den genetiska släktskapen mellan olika species inom genus Streptococcus.

Flera metoder måste kombineras för en tillförlitlig typning av de patogena streptokocker som orsakar övre luftvägsinfektioner.

i) Bedömning av kolonimorfologi och hemolys (orsakad av syrestabilt S-lysin) på väl definierade blodinnehållande substrat. Inkubationsmiljön påverkar i hög grad odlingsresultatet.

ii) Bestämning av grupptillhörighet enligt Lancefieldbaserade grupp- specifika polysackaridantigen, den s.k. C-substansen i cellväggen, genom agglutination, immunfluorescens eller immunenzymtest.

iii) Biokemiska test, företrädesvis Voges-Proskauer (VP). VP-positiva små, betahemolyserande kolonier hänförs till millerigruppen oavsett Lancefield-grupp.

Odlingsdiagnostik

Provtagning och transport

Pinnprov i SIFF transportmedium (Se också artikel avsnitt provtagning svalg

GAS överlever långa transporttider väl. Viss anrikning kan tom ske då antalet känsligare mikrober reduceras.

Primärisolering

Referensmedium: Dubbelskiktad fårblodagar (bil 3).

Den dubbelskiktade blodplattan underlättar bedömningen av hemolys men ger ingen ökad isoleringsfrekvens (1). Blod från tex häst hemolyseras av flera andra species och föranleder därför fler verifieringstest, Fårblod saknar tillräcklig mängd V-faktor (NAD) för att understödja växt av Haemophilus species. Agarbasen bör vara glykosfri eller ha ett lågt glykosinnehall då syrabildning från glykos hämmar hemolysinbildningen.

Selektivt medium: Interfererande mikroorganismer i normalfloran kan hämma utväxten av betahemolyserande streptokocker varför selektiva substrat har använts för att öka utbytet. Trimetoprim/sulfa, 25 mg/L (2), har beskrivits som selektivt tillägg i många studier. Kolistin (10 mg/L) tillsammans med oxolinsyra (5 mg) har angetts som alternativ (3) liksom gentamicin, 5 mg/L. Kristallviolett, 1 g/L, har använts framför allt som hämmare av Staphylococcus aureus. Vid användning av selektiva substrat får man alltid en mer eller mindre uttalad hämning även av de betahemolyserande streptokockerna. Möjligheten att studera relationen till övrig svalgflora går förlorad vilket ger en sämre helhetsbedömning. Selektiva medier bör därför alltid användas tillsammans med ett icke-selektivt substrat.

Utodling och inkubering: Hemolysen framträder bäst efter anaerob inkubering. Ett växlande antal stammar ger över huvud taget ingen hemolys vid aerob inkubering. Inkubering i C02-miljö kan ha negativ effekt genom att andra streptokockarter i normalfloran kan stimuleras och hämma GAS (2).

Avläsning, identifiering

Presumtiv diagnos: Stora kolonier med klar betahemolys i kombination med en bacitracinzon indikerar misstänkt GAS, varvid dock även vissa grupp C och G streptokocker kommer att inkluderas. Små kolonier, "pin-point", tillhör vanligen Streptococcus milleri-gruppen (S. anginosus). I denna grupp ingår subspecies som kan bära gruppantigen A, C eller G. S. milleri bär ofta grupp F-antigen. Samtliga är VP-positiva (4).

Slutlig verifiering: Grupptillhörigheten säkerställs genom agglutination med specifika antisera. immunfluorescens är ett accepterat alternativ. I tveksamma fall utförs VP-test för att utesluta S. milleri-gruppen som är VP-positiva. Observera att stammen skall föreligga i renkultur.

Indikationer för resistensbestämning

Hos grupp A streptokocker ses en ökning av isolat med resistens mot makrolidantibiotika (erytromycin, roxitromycin, klaritromycin och azitromycin). Lokala screeningundersökningar bör genomföras regelbundet tex 1-2 månader/år. Om incidensen av erytromycinresistens är >5 % bör införande av rutinmässig resistensbestämning av grupp A streptokocker övervägas.

Svarsrutiner

Serologiskt verifierade kolonier besvaras "Betahemolyserande streptokocker grupp A, C resp G."

Alternativa metoder för påvisande av GAS

Patientnära diagnostik av mikrobiologiika agens är inte något nytt. Innan penicillin kom i allmänt bruk utfördes såväl streptokockodling som difteriodling vid landets epidemisjukstugor. Diagnostiken togs så småningom över av lasarettslaboratorierna och senare av de bakteriologiska laboratorierna.

Referensdiagnostik: Referensdiagnostik för grupp A streptokocker (GAS) är odling vid bakteriologiskt laboratorium. Patientnära diagnostik av streptokocker måste ses som ett komplement till annan klinisk eller laboratoriemässig diagnostik.

Patientnära odling: Den patientnära diagnostiken av grupp A streptokocker fick ett uppsving i början av 80-talet då en kommersiell agarslide för odling lanserades. Under 80-talet utfördes patientnära streptokockodling på sådan slide eller på agarplattor inköpta från det bakteriologiska laboratoriet vid många vårdcentraler i landet.

Streptokockodling vid vårdcentral kan i tränade händer och med noggrann kontroll från centrallaboratoriet fås att fungera tillfredsställande. Den har dock inte bättre prestanda än de moderna snabbtesten och utgör därför inte längre ett meningsfullt komplement till diagnostiken. Eftersom patientnära streptokockodling dessutom är osäker vid dålig personalkontinuitet bör den avvecklas. Det måste understrykas att det inte är lämpligt att använda patientnära odling sporadiskt (t ex för att få lägre kostnader i samband med ett daghemsutbrott), eftersom kontinuerlig träning är en förutsättning för diagnostisk säkerhet.

Snabbtest: Under 80-talet lanserades immunologiska snabbtest för detektion av GAS i svalgprov. De första testen grundades på agglutinationsteknik. Dessa test har inte lika goda prestanda som de enzymimmunologiska eller immunkromatografiska test, som nu dominerar marknaden, och de är heller inte lika enkla att bedöma. Numera finns test som i utvärderingar mot odling på bakteriologiskt laboratorium ger en känslighet på över 90 %, vid riklig växt, och en specificitet på över 95 %. Utvecklingen går mot immunkromatografiska test med endast ett fåtal hanteringssteg.

Snabbtest för detektion av GAS i svalgprov skall endast användas för diagnostik vid kliniskt misstänkt GAS-infektion. Vid asymtomatiskt bärarskap, då bakterietalet ofta är lågt, har dessa test inte tillräcklig känslighet. Som vid all diagnostik måste man förvissa sig om att hela kedjan av anamnes, klinisk bedömning, provtagning, analysutförande och analystolkning fungerar, för att provresultatet ska vara användbart och tillförlitligt. Såväl intern som extern kvalitetssäkring är ett villkor. Man skall vara medveten om att streptokocker grupp C och G ej påvisas med snabbtest.

Epidemiologisk typning

Epidemiologisk typning av grupp A streptokocker kan vara aktuell vid större anhopning av streptokockinfektioner för att klarlägga spridningen men också för att följa förändringar i serotypmönstret över tiden i relation till uppträdandet av speciella streptokocksjukdomar, tex reumatisk feber, akut glomerulonefrit. De senaste årens utbrott av allvarliga, stundom dödligt förlöpande streptokockinfektioner har också visat på värdet av en epidemiologisk typning. Serotypning av streptokocker är inte någon rutinmetod vid diagnostiken av grupp A streptokocker i övre luftvägarna

Grupp A streptokockerna kan serologiskt indelas i ett 90-tal olika typer efter antigena skillnader i deras M-protein. Typningen baseras på extraktion av M-antigenet från bakterierna och precipitation i kapillärrör eller i Ouchterlonyplatta (diffusion-i-gel) med specifika antisera. Eftersom sådana sera är svåra att framställa och ej finns kommersiellt tillgängliga utförs dessa analyser endast på ett fåtal större streptokocklaboratorier i världen. Många streptokockisolat saknar M-antigen och som regel kan endast 40-50% av isolaten från övre luftvägarna M-typas.

En annan typindelning kan göras med ett enkelt agglutinationstest, sk T-typning. Alla grupp A streptokocker har på sin yta ett sådant T-antigen eller T-antigenkomplex som är trypsinstabila. Efter övernattsodling av en renkultur tvättas bakterierna och trypsinbehandlas 1 tim för att förhindra spontanagglutination och göra T-antigen tillgängligt för agglutination mot specifika sera. Dessa sera finns kommersiellt tillgängliga. Tyvärr skiljer sig T-typningsresultatet från M-typing på så sätt att flera M-typer kan återfinnas i en T-typsgrupp. Man kan delvis förbättra T-typningen genom att parallellt testa de aktuella bakterierna med avseende på förmågan att påverka svinserum, sk serum opacity reaction som är beroende av produktionen av ett lipas som ca hälften av alla streptokocktyper har och den andra hälften saknar (5). Typningsförfarandel är även i sitt enklare utförande behäftat med ett flertal problem och god erfarenhet krävs vid resultatbedömningen.

Under senare år har genetiska metoder utarbetats för noggrannare epidemiologiska utredningar rex "restriction and nuclear analysis of genomic DNA and analysis of DNA restriction fragment length polymorphism of rRNA genes" (6).

Referensstammar

• För typning:
  • GAS: CCUG 4207 (ATCC 12344)
  • GBS: CCUG 4208 (ATCC 13813)
  • GCS: CCUG 4211 (ATCC 35666, NCTC 8543)
  • GGS: CCUG 7975 (NCTC 9603)
  • GGS: CCUG 33802

• För resistensbestäinning:
  • GAS: CCUG 25570 (RAF-M26) erytromycinresistent
  • GAS: CCUG 25571 (RAF-M87) erytromycinkänslig

Antikroppsbestämning

Undersökning: Bestämning av antikroppar mot Grupp A streptokockers enzymer och toxiner.

• Metoder
  • a) Antistreptolysinbestänming (AS). Kan göras som en neutralisationstest, med latexagglutinalion eller med nefelometri.
  • b) Anti-DNAs B-bestämning utförs vanligen som en neutralisationsreaktion med streptokock-DNAs B som antigen (7).
  • c) Antitoxin. Antikroppsbestänming mot erytrogena toxin kan utföras som specialundersökning vid invasiva infektioner,
  • d) Antistreptokinasbestämning kan göras vid frågeställning om neutraliserande antikroppar förekommer inför streptokinasbehandling,

Indikation rör undersökning: Utredning för fastställande av eventuell genomgången streptokockinfektion. Speciellt viktigt vid misstänkt glomerulonefrit och reumatiska sjukdomar, men även vid vissa hud. sjukdomar som erythema nodosum och sällsynta fall av neurologiska sjukdomar. Har i allmänhet ingen plats vid rutindiagnostik av ÖLI.

Laboratorierapportering

Luftvägsisolat rapporteras ej.

REFERENSER

• 1. Dykstra MA, Mc Laughlin JC, Sankte RC. Compatison of medla and terhniques for detection of group A streptorocci in throat swab specimens, J Clin Microbiol 1979;9:236-238.

• 2. Kellogg JA. Minireview. Suitability of throat rulnare procedures for detsetton of group 4 streptococri and as reference standards for evaluation of atrepsocoera] alttigen detection kits. J Clin, Microbiol 1990;28:165-159,

• 3. Prisa DN. Coliatin-Oxolinic acid-blood agar: a new selective medium for streptococri. 3 din Microbiol 1954;19:4-?.

• 4. Efstratiou A, Colman 0. Halm 0, Timoney 31’. Boefgras IM, Monges 0. Biochemical differences anaong human md aninti steeptococci of Lanrefield group C or group 0.3 Med Mirrohlol 1994;41:145-148.

• 5. Maxted WR, Widdowson JO, Fraser dAM, Ball LC, nansen DCJ, The ene of lite serum opactey reaction in the typing of group A streptococci, 3 Med Miorobiol l9736:83-O0.
• 6 Seppälä H, Wuopio-Varkila 1, österblad M, Jahkola lsL Rummukaincil kL Holm SE, Hoovinen P. Evatuation of nietbods for epidrniiologrc typing of Group A streptococci. J Infeet Dis 1994;169:519-525.

• 7. Klein CC, Baker CN. Addison av, Moody MD. Microteat for Streptococcal AntideoxyribottUclease B. Appi Mrcrobiol t969ls:2o4-206.