Provsättning

Till innehållsförteckngen för Referensmetodik: Bakteriologisk diagnostik av infektioner i hud, mjukdelar, skelett och inre organ

---

EJ redigerad

Provsättning

Allmän odling, referensmetodik

1. Aerob odling

Alla typer av prov, definierade i tabell 6, odlas primärt på blodagar, hematinagar och CLED-agar. I förekommande fall sätts prov också till anrikningsbuljong, FAB. Prov som anländer till laboratoriet i blododlingsflaskor, inkuberas upp till 10 dygn och sekundärsprids närhelst indikation till växt föreligger. Sådana prov som utgörs av fast vävnad etc., vilka överförs till anrikningsbuljong, sekun¬därsprids på agarplattor av samma sort. Buljongen inkuberas totalt 10 dygn. 2. Anaerob odling, rutinnivå

Metoden avser miniminivå för anaerob odling som i förekommande fall kompletterar aerob odling, se också tabell 6, fotnot 4. Prov inokuleras på anaeroba blodplattor, FAA (se nedan), som görs semiselektiva genom applikation av aminoglykosid- och metronidazollappar i primärstryket (se tabell 6, fotnot 5). Inokulera även anaerob buljong (FAB) som inkuberas aerobt eller anaerobt.

De anaeroba blodplattorna bör vara prereducerade eller färska. Inokulering sker i anaerobbox (referensmetod), men aerob provsättning med sekundär inkubering i klocka med gasgenererande kuvert som t.ex. Anaerogen (OXOID) eller i klocka med evakueringssystem är accepterad alternativ metodik. Med kuvert erhålls god anaerobios tillräcklig för flertalet kliniskt relevanta anaeroba bakterier. Med resazurin som indikator garanteras redoxförhållanden ≤ 110 mV. Avläs dag 2 eller efter medicinsk bedömning. Observera att anaerobt inkuberade plattor inte bör exponeras för luft under de första 48 timmarna. Vissa långsamväxande arter, hit hör peptostreptokocker och svartpigmenterade gramnegativa stavar som Porphyromonas, Prevotella, och Bilophila kan behöva inkuberas ytterligare en eller flera dagar för detekterbara kolonier. Andra anaeroba bakterier, t.ex. Actinomyces kan behöva 7-10 dagars inkubationstid. FAB granskas för växt dagligen upp till 10 dygn. Den förenklade anaeroba odlingen är med beskrivna förbehåll fullt acceptabel i rutindiagnostiken. Det enskilda laboratoriet definierar utifrån denna miniminivå eventuell modifiering av anaerobdiagnostiken, innefattande förlängd inkuberings¬tid, bruk av selektiva medier (se nedan), särskilt i de fall anaerob odling speciellt begärts.

3. Anaerob odling, jämförelsenivå

Metoden bör användas vid studier men kan även användas i rutinen efter särskild medicinsk bedömning. Prov inokuleras på prereducerade eller färska anaeroba blodagarplattor, d.v.s. FAA, samt två typer av selektiva FAA; kana-vanko-agar och neomycinagar (enligt bilaga 1). Inokulera även anaerob buljong (FAB) i före¬kommande fall och inkubera denna anaerobt. För anaerob miljö används anaerobbox i vilken all hantering av provet sker (miljö 10 % H2, 5-10% CO2, 80-85 % N2. Alternativ är inkubering i någon typ av klocka (se under punkt 2). Inkubera anaeroba plattor och eventuell buljong 10 dygn. Daglig avläsning.

Speciell odling, referensmetodik

Val av medier, atmosfär, temperatur och inkubationstid beskrivs i tabell 7.

Tabell 6. Allmän aerob och anaerob odling, referensmetodik

Inkubationsatmosfär (35-37 C), tid (dygn) Ae/A Blod- odl.- flaska Blod- agar4

Luft Hematin- agar4

CO2 CLED- agar4

Luft Anaerob Blod- agar 4, 5, 6 Anaerobt FAB

Ae/An Sekret från öppen provlokal; sår1, fistel 2 2 2 2/10 Sekret från sluten provlokal med förvän¬tad polymikrobiell floratyp;+ abscess, cellulit, pilonidalcysta, ”pus i buk”, galla, peritonealvätska, pleuravätska 2 2 2 2/10 10 Normalt sterila kroppsvätskor med förväntad monomikrobiell floratyp; amnionvätska , ascites, ledvätska , perikard¬vätska, synovialvätska, (bursa) Subkultivering vid växt i blodod¬lingsflaskor 10 2 2 2 2/10 Fast vävnad, biopsi, ej kroppseget material (kärlkatetrar, skruvar, implantat) med förväntad monomikrobiell floratyp; Vävnad, biopsi samt ej kroppseget material. Subkultivering av FA-buljong 10 2 2 2 2/10 Fast vävnad, obduktionsmaterial, ej kroppseget material (dränage) med förväntad polymikrobiell floratyp. 2 2 2 2/10 10 Ej kroppseget material med förväntad polymikrobiell floratyp; Spiral 2 2 2 2/10 10 CAPD-vätska 2 2 2 2/10 10 Sekret, vulva, vagina2 2 2 2 Sekret cervix3 2 2 2 2/10 Fotnot till Tabell 6: 1. Anrikning i buljong av pinnprov anses ej indicerat. 2. Sexuellt överförbara sjukdomar, se referensmetodik I 6. Prediktivitet kan inte anges för patogenicitet för prov från nedre genitalia förutom vissa specifika fråge¬ställningar (t.ex. Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis) samt för prov från prepubertala flickor med avseende på vanliga övre luftvägspatogener (t.ex. Haemophilus influenzae, S. pyogenes). Odling på prov från vagina kan vara indicerat hos prepubertala flickor samt vid svampfrågeställning. Se även speciell odling, GBS-odling. 3. Cervixodling kan spegla etiologier vid PID men har låg specificitet, se avsnitt infektioner i inre genitalia. Med tanke på normalflorans sammansättning och dominansen av anaerober vid rubbad normalflora torde även negativa svar av typen ”Ordinär flora” kräva anaerob odling. 4. Vid följande kliniska remissuppgifter är det acceptabelt att enbart inkubera i luft samt CO2-miljö: Follikulit, Furunklar/karbunklar, Impetigo, Bullös impetigo, Ritters sjukdom (SSSS), Ektyma, Erysipelas, Erysipeloid, Puerperal mastit, Dak¬rocystit, Toxic shock syndrome (TSS), Infektioner i penis, Prostatit, Epididymit, Bakteriell orkit, Vagina, Venösa bensår, Brännskador, Okänd/Ingen diagnos. Övriga kliniska diagnoser inkuberas enligt ovan. 5. Lägg gentamicin (30 μg) - och metronidazol (10 μg) - lappar i primärstryket. Anaeroba bakterier växer oftast in i gentamicinzonen men ej i metronidazolzonen. 6. Selektiva anaeroba odlingsmedia inkuberas 10 dygn.

Tabell 7. Speciell odling, referensmetodik

Inkubationsatmosfär (35-37 C), tid (dygn) Fårblod- agar CO2 GBS- buljong CO2 MSA

Luft VRE- buljong Luft CLED-agar Luft GBS 2 1 Multiresistenta bakterier (MRSA, VRE, multiresistenta gramnegativa stavar) 2 1 1 Actinomyces spp, Bartonella spp, Borrelia spp, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, Leptospira spp, No¬cardia spp, Streptobacillus moniliformis, Bacillus anthra¬cis, Brucella spp, Burkholderia mallei och pseudomallei, Francisella tularensis, Rickettsia spp, Yersinia pestis Se Agens associerade med specifika sjukdomstillstånd respektive Klass 3 organismer

Inokulering av medier

Allmänt

Inokulera alltid medier i en bestämd ordning med det minst selektiva mediet först. Provmaterialet kan kastas en vecka efter att provet primärodlats, eller efter medicinsk bedömning. Lämpliga metoder för provapplikation på agarplattor beskrivs i figur 7 och 8. Märk först agar¬plattorna med Labnr och inokuleringsdatum. Primärstryk i förekommande fall med provtagningspinne (fig 7) eller applicera ca 100 L material på plattan (fig 8).

Figur 7. Inokulering av agarplattor med provtagningspinne. Gör först ett rakt primärstryk. Stryk sedan vinkelrätt mot detta första stryk. Rotera pinnen under hela stryket. Återställ provtagningspinnen i transportröret. Sekundärstryk med plastinös enligt 2 och 3.

Figur 8. Inokulering av agarplattor med flytande material. Primärstryk agarplattorna med plastinös enligt 1. Stryk först ett rakt stryk. Stryk sedan vinkelrätt mot detta första stryk. Sekundärstryk med plastinös enligt 2 och 3.

Inokulering av flytande medier

Märk buljongrör med Labnr och inokuleringsdatum. Ta provmaterial med engångs plastpipett/sterila instrument och inokulera mediet.

Direktmikroskopi

Märk objektglas med Labnr. Ta provmaterial med engångs plastpipett/sterila instrument och stryk på ob¬jektglaset.

Provmaterialrelaterad beskrivning Allmän odling Sekret pinnprov i transportrör Öppna transportröret och ta ut provtagningspinnen. Inokulera och inkubera medier. Sekret i anaerob transportflaska eller sterilt rör/kärl Homogenisera innehållet genom att vortexa eller vända det förslutna röret några gånger. Öppna röret och ta material med engångs plastpipett. Förslut röret. Inokulera och inkubera medier. Gör anaerob odling först. Vävnad i sterilt rör/kärl Öppna röret och ta material. Placera materialet i steril mortel. Homogenisera materialet i steril mortel. Tillsätt lite FA-buljong om provet är torrt. Inokulera och inkubera medier. Gör anaerob odling först. Vävnad i FA-buljong med tecken på växt vid ankomst Vortexa eller vänd det förslutna röret några gånger. Öppna röret och ta material med engångs plastpipett. Förslut röret. Inokulera och inkubera medier. Gör anaerob odling först. Vävnad i FA-buljong utan tecken på växt vid ankomst Inkubera röret. Inokulera och inkubera medier vid tecken på växt. Vid tveksamhet om växt är det lämpligt att gramfärga buljongen samt subkultivera till agarplattor.

Ej kroppseget material i FA-buljong Inkubera i 10 dygn i 35  - 37 C. Inokulera och inkubera medier vid tecken på växt. Vid tveksamhet om växt är det lämpligt att gramfärga buljongen samt subkultivera till agarplattor. Ej kroppseget material i sterilt rör/kärl med förväntad monomikrobiell floratyp Öppna röret och placera materialet i FA-buljong. Inkubera i 10 dygn i 35  - 37 C. Vid växt ta material från buljongröret. Inokulera och inkubera medier.

Ej kroppseget material i sterilt rör/kärl med förväntad polymikrobiell flora¬typ (spiral, dränage) Placera under anaeroba och sterila betingelser. • spiralen i steril petriskål och tillsätt FA-buljong. Skaka försiktigt. • alternativt i FA-buljongrör och vortexa. Inokulera medier med hjälp av plastpasteurpipett. Gör anaerob odling först. Blododlingsflaskor med tecken på växt vid ankomst Odla ut vid ankomsten. Inokulera och inkubera medier. Tillsätt näringssubstrat enligt tillverkarens anvisningar. Inkubera flaskorna ett dygn i 36 °C innan eventuell ny utodling (eller tills blod¬odlingssystemet signalerar). Om det växer rikligt på direktutodlade medier behöver provet inte odlas ut igen. Blododlingsflaskor utan tecken på växt vid ankomst Tillsätt näringssubstrat enligt tillverkarens anvisningar. Inkubera flaskorna i 36 °C och avläs i fem dygn (eller tills blododlingssystemet signalerar) innan eventuell utodling. Inokulera och inkubera medier. CAPD (PD), dialysvätska Desinficera dialyspåsen. Aspirera 100 mL dialysvätska och sätt till 2st 50 mL centrifugrör. Centrifugera båda rören i 2000 x g, 10 min. Sug av ovanvätskan med steril engångspipett av plast. Kasta ovanvätskan. Om endast liten mängd sediment, lämna kvar totalt ca 2 mL i röret för utodling. Inokulera från sedimentet: 0,1 mL/agarplatta samt 0,5 mL till anrikningsbuljong. Lägg ev. material på ett märkt objektsglas för direktmikroskopi. Om blododlingsflaskor eventuellt använts, åtgärdas de enligt ovan. Speciell odling GBS-odling Inokulera provtagningspinnarna från vagina respektive rektum tillsammans i anrikningsbuljong för grupp B streptokocker, ”GBS-buljong”. Inkubera buljongen i 1 dygn 35 -37 C. Inokulera en fårblodagarplatta med den inkuberade buljongen. Inkubera plattan i 35 -37 C. Avläs efter 1 dygn. Om ingen växt av GBS, reinkubera agarplattan 1 dygn .