Spa-typning av Staphylococcus aureus och MRSA

Sida under bearbetning april 2012. Innehållet är preliminärt i väntan på konsensusförfarande

---

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Molekylärbiologisk diagnostik

och

falldefinitionen MRSA (meticillinresistenta Staphylococcus aureus, gula stafylokocker)

---

spa-typning av Staphylococcus aureus och MRSA

Bakgrund

Vid spa-typning analyseras genom sekvensering den polymorfa variabla regionen X i protein A genen (spa). Genen finns hos alla bakterier av arten S. aureus och kodar för protein A på cellytan. X-regionen består av ett variabelt antal 24 basparsrepetitioner flankerat av väl konserverade regioner. spa-typning drar nytta av tekniska fördelar som snabbhet och reproducerbarhet och den är också på ett enkelt sätt kommunicerbar. Typning är enkel men kräver apparatur för DNA-sekvensering.

Det finns en internationellt erkänd nomenklatur där resultatet av spa-typning uttrycks enligt ett system som utarbetats vid universitetet i Münster i Tyskland och som nu används av alla länder i Europa. För ändamålet finns en väl underhållen internetbaserad global databas (StaphType, RidomSpaServer.ridom.de) som underlättar det epidemiologiska arbetet och möjliggör också jämförelser mellan länderna.

Mellan åren 2000 till 2006 typades vid SMI alla insända isolat av MRSA med PFGE och en nationell databas byggdes upp. Sedermera har man övergått till att utföra spa-typning för för kartläggning av smitta med S. aureus och MRSA. I vissa sammanhang, framför allt i samband med internationella jämförelser av isolat, både inom och utom Europa, kan även en annan typningsmetod, så kallad multi locus secquence typing, (MLST), användas. För att säkrare kunna kartlägga ett utbrott, framförallt med de vanligaste spa-typerna, är komplettering med PFGE fortfarande användbar.

I Sverige är spa-typerna t002, t008 och t044 vanligast med över 100 isolat vardera under år 2008. De tio vanligaste typerna står för cirka 50 procent av de svenska fallen.

Utförande

Nedan visas översiktligt hur en Spa-typning går till. För utförandet behövs PCR-instrument, sekvenseringsinstrument och programvaran Ridom StaphType (Ridom GmbH).

Utgångsmaterial är kolonier av S. aurues- eller MRSA-isolat på agarplatta. DNA extraheras med gängse metodik. Vanligen används lysostaphin i rumstemperatur följt av proteinase K vid 56° C. därefter inkuberas provet 15 min. 95° C varefter templatet späs 1/100 i vatten.

Nukleinsyraamplifiering görs med följande primrar

• Primer SPA 1113f sekvens; 5’ TAA AGA CGA TCC TTC GGT GAG C 3’
• Primer SPA 1514r sekvens; 5’ CAG CAG TAG TGC CGT TTG CTT 3’

Mix/PCR-rör

• Mastermix för 24 prov
  • 24 µL, 10 pmol/µL SPA 1113f
  • 24 µL, 10 pmol/µl SPA 1514r
  • 120 µL, reaktionsbuffert x 10 Taq enzym dilution
  • 6 µL, 5U/µl Taq DNA polymeras
  • 96 µL, 10mM dNTP/dUTP mix (Fermentas)
  • 72 µL, 30 mM MgCl2
  • 615 µL destillerat sterilt DNase och RNase fritt vatten

Till varje PCR-kapillärrör sätts 10 µL färdigberett templat 10 pg/µL.

PCR-program för amplifiering av nukleinsyra

• 10 min 80°C
• 35 cycler omfattande 45 sek 94°C, 45 sek 60°C och 90 sek 72°C
• programmet avslutas med en cycel 10 min 72°C.

PCR-produkt renas därefter från ej inkorporerade primrar och dNTP. Exempelvis kan QIAquick PCR purification Kit användas enligt tillverkarens rekommendationer.

Sekvensering av PCR-produkten

• Inmärkning görs i 0,2 mL microrör
  • 4 µL Primer SPA 1113f
  • 4 µL BigDye Terminator ready reaction cycle sequencing kit 1.1 (Life technologiesTM)
  • 2 µL reaktionsbuffert
  • 3 µL mål-DNA (PCR-produkt från ovanstående reaktion)
  • 7 µL vatten

PCR-programmets utformning vid inmärkning för sekvensering

• 25 cycler; 15 sek 96°C, 10 sek 50°C och 4 min 60°C därefter 5 sek 60°C och 60 sek 15°C

Inmärkt PCR-produkt renas därefter inför sekvenseringen. I ett första steg fälls den inmärkta produkten med NaAc och 95%-ig etanol och värms i 90°C. Efter centifugering tvättas pelleten i 70%-ig etanol som avlägsnas, i ett sista steg, genom indunstning vid 90°C. Den nu renade produkten blandas med formamid, centrifugeras, värms i 90°C och ställs sedan kortvarigt på frysblock. Därefter överförs produkten till ett sekvenseringsrör.

Analys av sekvenseringsresultatet

Det vid sekvenseringen erhållna resultatet (som repeat-följd) överförs i programvaran Ridom StaphType (Ridom GmbH) och den aktuella stammen erhåller på så sätt ett spa-typ.

REFERENSER

• 1. Frénay HM et al. Molecular typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus on the basis of protein A gene polymorphism. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 1996 Jan;15(1):60-64

• 2 Stefani S et al. Methicillin-ersistnat Staphylococcus aureus (MRSA): global epidemiology and harmonisation of typning methods. Int J Antimicrob Sgents. 2012 Apr;39(4):273-82