Genital herpes simplex-laboratoriediagnostik

Huvudartikel:Genital herpes simplex-infektion

Se även Nukleinsyrabaserad metod för påvisning av Herpes simplexvirus-bilaga8

---

Genital herpes simplex

Referensmetodik

HSV-DNA –påvisning med realtids-PCR

DNA-analys med PCR-teknik är en väl utvärderad metod såväl för mukokutan HSV som för HSV-infektioner i centrala nervsystemet, och analysen bestämmer HSV-typ direkt under körningen (1). Realtids-PCR bör numera betraktas som standard-och referensmetod för HSV-diagnostik avseende genital herpes på grund av sin robusta metodik, sin oöverträffade sensitivitet och höggradiga specificitet. Metoden ställer lägre krav på snabb och kyld transport jämfört med virusisolering, eftersom virus här ej behöver vara viabelt för analys. PCR-detektion av HSV utförs vid samtliga av landets virologiska laboratorier.

Provtagningsmaterial och utförande

HSV-DNA i blåssekret kan detekteras direkt med PCR utan föregående DNA-extraktion, medan t.ex. vävnadsprover lämpligen extraheras före detektion. Kvantitativ PCR för HSV är en PCR-metod med hög sensitivitet där små mängder HSV-DNA kan detekteras utan korsreaktion med andra virus i herpesgruppen eller humant DNA (1).

Ett TaqMan-instrument används för att logaritmiskt replikera (amplifiera) korta segment av genen för HSV-1 och HSV-2 glykoprotein B. Denna gen är väl konserverad, men innehåller även kortare typ-specifika sekvenser. Vid denna realtids-PCR med hjälp av s.k. TaqMan-teknik används primrar där reverseprimern är gemensam medan forwardprimers är typspecifika. Vidare används två korta probe-sekvenser som är typspecifika och inmärkta med olika fluorescensfärger. Om HSV-1 eller HSV-2 DNA 2 amplifieras kan respektive probe hybridisera (binda) och emittera (sända ut) fluorescens vars intensitet avspeglar PCR-reaktionens förlopp och vars färg avgör provets HSV-typ. Cykeltalet vid positiv reaktion (det s.k. CT-värdet) är omvänt proportionellt mot DNA-mängden i provet och kan därför användas för att beräkna HSV-DNA-mängden i provet. I STI-diagnostisk praxis är sådan kvantifiering dock ej nödvändig i nuläget. Påvisande av HSV-DNA oavsett mängd leder till att provet besvaras positivt för aktuell HSV-typ.

Som positivt kontrollmaterial används antingen HSV-infekterat cellmaterial, eller plasmider där genen för glykoprotein B är inklonad. Positiva kontroller i spädning skall köras vid varje analystillfälle för att säkerställa korrekt DNA-amplifiering.

Prestanda

Specificiteten hos analysen är 100 %. Korsreaktion mellan HSV-1 och HSV-2 har inte noterats ens vid mycket höga viruskoncentrationer. Inte heller har korsreaktion med andra herpesvirus observerats. Sensitiviteten är högre än virusisolering: cirka 15-20 % av prover som är negativa vid virusisolering är positiva med realtids-PCR. Prestanda för varje körning kontrolleras och dokumenteras genom att Ct-värde för positivkontroller samt andel positiva prover i procent anges på kontrollista.

I bilaga 8 ges ytterligare ett exempel på PCR-metod för diagnostik av HSV. Metoden används vid Folkhälsomyndigheten.

Alternativa diagnostiska metoder

Virusisolering (odling)

Virusisolering, som tidigare var standardmetod, har fortfarande ett berättigande när man senare behöver ha tillgång till en virusstam, t.ex. vid resistensprövning eller vid patogenicitetsstudier. Det är vidare av vikt av epidemiologiska skäl att ha en virusbank för att följa evolutionära förändringar hos HSV.

• Isoleringsteknik: Det insända provmaterialet slammas upp och inokuleras i vävnadskulturer med dokumenterat hög känslighet för ett spektrum av herpes-stammar tillhörande typ l och 2. Ett flertal känsliga cellinjer finns (2); vanligast i Sverige är GMK-AHl celler. Avläsningen av kulturerna sker dagligen med avseende på cytopatogen effekt. Fyndet skall säkerställas med hjälp av identifiering av herpes simplex-antigen i celler (immunofluorescens) eller överskiktsvätska (vanligen ELISA) innan definitivt svar lämnas. Identifieringen kombineras lämpligen med typning med hjälp av specifika antikroppar eller PCR. En ständig övervakning av använda cellers känslighet är en god kvalitetskontrollerande åtgärd.

• Svarstid: 50-70 % av virusstammarna kan identifieras inom 1-2 dygn. Negativt svar ges som regel efter en vecka.

Karakterisering av herpesstammar

Typning är ofta av intresse t.ex. för att bedöma risk för kommande recidivfrekvens efter en primärinfektion: herpes typ l genitalt recidiverar mer sällan än typ 2. Vid vissa frågeställningar är typningen av största värde för bedömningen tex vid neonatal herpes; typ l har avsevärt bättre prognos än typ 2. Typning av herpesstammar har vidare epidemiologiskt intresse.

Typning utförs på laboratorier som arbetar med isolering av herpesvirus i vävnadskulturer.

Epidemiologiska samband, d.v.s. definierad smittoöverföring, kan inte fastställas genom genotypning eller sekvensering av HSV-amplifikat eller isolat. Ett hinder är förekomst av betydande sekvensvariabilitet inom varje patient.

Resistensbestämning är aktuell främst vid behandling av immunsupprimerade patienter. Utförs i vävnadskultur eller med molekylärvirologisk teknik genom sekvensbestämning av identifierade regioner i genomet med PCR-teknik. Utförs rutinmässigt på Folkhälsomyndigheten samt klin. virologiska laboratoriet vid Sahlgrenska sjukhuset i Göteborg.

Antigenpåvisning med immunofluorescens

Immunofluorescensmetoden är vid sidan av PCR den snabbaste för påvisning av HSV-infektioner. Denna metodik används alltmer sällan i rutindiagnostik till förmån för PCR-metodik. Resultatet är mycket avhängigt av provtagningen. Mindre tillfredsställande provtagning leder till obedömbara preparat. Metodens känslighet ligger kring 80 % eller ännu lägre vid smärre genitala förändringar. En ganska stor provvolym utgör förutsättning för att tillräcklig erfarenhet att bedöma preparaten skall uppnås på laboratoriet. Stor risk för felbedömning föreligger vid bristande vana. En fördel med denna teknik är att man genom direktinspektionen får en uppfattning om det insända provets representativitet.

En fortlöpande kontroll genom direktkontakt med klinisk virolog och möjlighet till kompletterande utredning med herpes virus-odling (isolering) i vävnadskultur är förutsättning för god kvalitet på undersökningen. Vid viktiga ställningstaganden bör alltid prov för virusisolering insändas samtidigt!

Immunofluorescensteknik lämpar sig bäst för herpesdiagnostik från blåsa/sår under tidsperioden före krustabeläggning däremot ej från exempelvis cervix. Förutsättning för god träffsäkerhet är en noggrann provtagning som ger representativt material av basalceller från botten av färskast möjliga blåsa/sår utan tillblandning av slem (2). Provtagningen kräver därför viss vana och eftertanke.

• Färgning på laboratoriet: På laboratoriet färgas insända objektglas med intorkat provmaterial. Ett flertal monoklonaler och polyklonala sera av god kvalitet finns på marknaden. Direktkonjugerade reagens är att föredra eftersom bakgrundsfärgning utgör mindre problem och metoden blir mindre tidskrävande. En enda typisk fluorescerande cell räcker för positiv bedömning. Minst 50 negativa karakteristiska basalceller bör krävas för att ge ut ett negativt svar.

• Tidsåtgång för färgning (1/2-l tim), bedömningstid varierar beroende på preparatets kvalitet. Svar kan som regel ges inom 1 - 2 timmar efter det provet anlänt till laboratoriet.

Serologisk undersökning

Diagnosen primär infektion kan ställas med serologisk undersökning (analys av HSV specifik aktivitet av olika antikroppsklasser mot typ 1 - 2 gemensamma antigen eller typspecifika antigen). Antikroppssvar av klass IgG och IgM kan påvisas efter 7 - 10 dagar; IgM klingar av inom loppet av någon till några månader. IgG-aktivitet mot HSV kvarstår däremot sannolikt livslångt. Antikroppsstegring kan påvisas mellan akut (snarast möjligt efter insjuknandet) och konvalescensfas (2-3 veckor efter insjuknandet). Vid recidivinfektion däremot har patienten som regel en hög stationär HSV-IgG-aktivitet och antikroppsstegring kan ej påvisas. HSV-diagnosen vid en recidiv¬infektion måste därför baseras på viruspåvisning. Serologisk undersökning av prov taget samtidigt med blåsdebut är alltså ett utmärkt komplement till HSV-PCR och isolering om man vill fastställa om HSV-infektionen är av primär eller recidiverande natur.

Analys av HSV-typspecifik IgG-aktivitet kan särskilja mellan infektion med HSV-1 eller HSV-2, och kan även ange samtidig HSV-1/HSV-2-infektion. Särskilt värdefull är serologi när man i lugnt skede saknar viruslesioner men behöver information om infekterande virustyp. Metoden användes exempelvis för att fastställa tidigare genomgången HSV-2-infektion hos individen, eller för att diagnostisera en primär HSV-2-infektion hos en patient som tidigare infekterats med HSV-1. Den typspecifika serologin är vidare användbar för prevalensstudier av såväl HSV-2 som HSV-1 (3). För patienten är serologisk diagnos av genital herpes viktig då det föreligger större recidivrisk vid genital HSV-2-infektion jämfört med vid infektion med HSV-1, samt större risk för överföring till fostret vid förlossning (neonatal herpes, se ref. 4).

För båda virustyperna gäller att glykoprotein G (gG) som enda höljeprotein (av totalt elva stycken) från respektive virus inducerar typspecifika antikroppssvar och därför kan användas som antigen för serologiska analyser (5). Antigenen framställs vanligen med rekombinantteknik men kan också renas fram med lektinrening (gäller gG-2). Epitoperna hos gG-1 och gG-2 är kartlagda och har visats vara väl konserverade (6).

Antikroppsanalyserna, som finns kommersiellt tillgängliga, eller som in-house test, utförs som regel med ELISA-teknik. Typspecifika test kräver mycket noggrann standardisering mot kända paneler. Svaren anges antigen som positivt eller negativt, men kan också anges som högsta positiva spädningstiter. Western blot-teknik utgör referensteknik för typspecifik antikroppsanalys. Typspecifika antikroppsanalyser avseende HSV finns tillgängliga på de flesta virologiska laboratorier.

Laboratorierapportering

Ej anmälningspliktig infektion.

Hänvisningslaboratorium enligt gällande virologisk R-lista Folkhälsomyndigheten (Maria Brytting) Virologiska laboratoriet, Guldhedsgatan 10, 413 46 Göteborg (Tomas Bergström).

REFERENSER

• 1. Namvar L, Olofsson S, Bergström T, Lind M. Detection and typing of herpes simplex virus (HSV) in mucocutaneous samples by TaqMan PCR targeting a gB segment homologous for types 1 and 2. J Clin Microbiol 2005; 43:1-7.

• 2. Herpes Simplex Viruses. In Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infections. Eds. N J Schmidt and R W Emmonds. 6th edition, 265¬317, 1989.

• 3. Sexually transmitted infections. Eds. Dan Danielsson and Erik Lycke: Nahmias A J, Lee F K and Beckman-Nahmias S. Sero-epidemiological and sociological pattems of herpes simplex virus infection in the world. Scand J Infect Dis. Suppl 69:19-36, 1990.

• 4. Forsgren M. Genital herpes simplex virus infection and incidence of neonataldisease in Sweden.Scand J Infect Dis. Suppl 69: 37-41, 1990.

• 5. Bergström T, Trybala E. Antigenic differences between HSV-1 and HSV-2 glycoproteins and their importance for type-specific serology. Intervirology 1996;39:176-184.

• 6. Tunbäck P, Bergström T, Löwhagen G-B, Hoebeke J, Liljeqvist J-Å. Type-specific reactivity of anti-glycoprotein G antibodies from herpes simplex virus infected patients is maintained by single or dual type-specific residues. J Gen Virol 2005; 86:247-251.