Nukleinsyrabaserad metod för påvisning av Herpes simplexvirus-bilaga8

Från Referensmetodik för laboratoriediagnostik
Hoppa till navigering Hoppa till sök

Artikel publicerad år 2009

Huvudartikel:Genital herpes simplex-infektion

Sekundärartikel till:Genital herpes simplex-laboratoriediagnostik


Kvantitativ PCR för HSV-1 och HSV-2 vid Folkhälsomyndigheten[redigera]

Indikation[redigera]

Misstanke om infektion med Herpes simplex virus typ 1 eller 2 (HSV-1, HSV-2). Med kvantitativ polymerase chain reaction (PCR)-analys är det möjligt att detektera och kvantifiera antalet virusgenom i provmaterial vilket kan utnyttjas för att följa utvecklingen av genomantal vid behandling.


Analysprincip/teststrategi[redigera]

Med PCR-teknik amplifieras specifika nukleinsyrafragment (DNA-fragment) i närvaro av en fluorescerande probe. Mängden ursprungligt templat i okända prov kvantifieras genom att signalen från proben jämförs med en standardkurva generad från prov med en känd mängd templat. PCR-analysen kan dock inhiberas av olika faktorer exempelvis hämoglobin och proteinkomplex som kan finnas i de kliniska provmaterialen. På grund av detta måste alla prov extraheras innan PCR-analys. Innan extraktion tillsättes sälherpes (PhHV-1) till varje patientprov (spikning), som extraktionskontroll och inhibitionskontroll för prov i PCR-analysen.

Provmaterial Misstänkt diagnos / Symtom Virus Provmaterial CNS-infektion HSV-1 HSV-2 Cerebrospinalvätska Blåsor HSV-1 HSV-2 Blåsinnehåll

  • Blåsinnehåll: Förvaras i rumstemperatur, kyl eller frys.
  • Cerebrospinalvätska (CSF): volym > 200 µL. Förvara i rumstemperatur, kyl eller frys.
  • Provtagningsmateriel
    • Blåsinnehåll: Virocultrör eller sterilt rör med 250 µL NaCl.
    • Cerebrospinalvätska (CSF): Sterilt rör utan tillsats.


Provtransport[redigera]

  • Blåsinnehåll: Kan transporteras i rumstemperatur.
  • Cerebrospinalvätska (CSF): Kan transporteras i rumstemperatur.


Reagenser[redigera]

  • Mag Attract® DNA Mini M48 kit, Qiagen art nr: 953336 (extraktion av vätskor i BioRobot M48)
  • QIAamp® DNA Blood Minikit, Qiagen art nr: 51106 (manuell extraktion av vätskor)
  • Positiv extraktionskontroll för säl (PhHV-1)
  • TaqMan® Universal PCR MasterMix, ABI art nr: 4318157
  • MgCl2, 25 mM
  • Probe för de olika PCR-systemen
  • Primrar för de olika PCR-systemen
  • Standard (extraherade Namalvaceller som innehåller integrerat EBV DNA)
  • Positiv kontroll (acceptor) för de olika PCR-systemen
  • Negativ kontroll (NTC) för de olika PCR-systemen

Prober och primrar[redigera]

  • Probe för de olika PCR-systemen
    • HSV-1: 5'FAM-CAGCACACGACTTGGCGTTCTGTGT-3'TAMRA
    • HSV-2: 5'FAM-CAGACAAACGAACGCCGCCG-3'TAMRA
    • Säl: 5'FAM-TTTTTATGTGTCCGCCACCATCTGGATC-3'TAMRA
  • Primrar för de olika PCR-systemen. Primrarna i HSV-1-systemet är riktade mot US5-genen.
    • HSV-1 forward: 5'-GGCCTGGCTATCCGGAGA-3'
    • HSV-1 reverse: 5'-GCGCAGAGACATCGCGA-3'
  • Primrarna i HSV-2 systemet är riktade mot US4-genen.
    • HSV-2 forward: 5'-AGATATCCTCTTTATCATCAGCACCA-3'
    • HSV-2 reverse: 5'-TTGTGCTGCCAAGGCGA-3'
  • Primrarna i säl Hv-systemet är riktade mot gB-genen.
    • Säl forward: 5'-GGGCGAATCACAGATTGAATC-3'
    • Säl reverse: 5'-GCGGTTCCAAACGTACCAA-3'


Analysprocedur[redigera]

  • Sammanfattning
    • Extraktion av DNA med valt extraktionskit. Innan extraktion tillsättes en inhibitions-kontroll till varje prov (sälherpesvirioner). Om prov spädes ut/koncentreras skall hänsyn tas till det vid beräkningen av genomkoncentrationen. Vid varje extraktion ingår även en extraktionskontroll som extraheras parallellet med övriga prov.
    • Rena mixar bereds i templatfritt rum.
    • I provtillsättningsrummet blandas extraherat prov med PCR-mixarna. Prover och kontroller fördelas i en 96-hålsplatta. Alla prover analyseras i duplikat för respektive PCR system. Alla prover analyseras även för sälherpes PCR systemet i en brunn (fungerar som inhibitions- och extraktionskontroll). Standard är 4 brunnar med cirka 5 EBV genom/brunn, 2 brunnar av vardera 50, 500, 5000 samt 50000 EBV genom/brunn. NTC (reagenskontroll utan templat, negativ) för respektive PCR system, i triplikat. Acceptor (positiv kontroll, cirka 20-50 genom/brunn) för aktuella PCR system, i triplikat. Slutvolymen på 25 µL i varje brunn består av 5 µL extraherat prov/kontroll och 20 µL PCR-mix.
    • Alla brunnarna försluts. PCR-analysen sker och analyseras direkt i PCR maskinen.
  • Bedömning
    • För att ett prov skall bedömas som negativt skall båda brunnarna med aktuellt prov vara negativa. Samt att inhibitionskontrollen skall vara positiv, bör vara minst 20% positiv jämfört med extraktionskontrollens värde (sälherpes).
    • För att ett prov skall bedömas som positivt skall båda brunnarna med aktuellt prov vara positiva. Samt att inhibitionskontrollen skall vara positiv, bör vara minst 20% positiv jämfört med extraktionskontrollens värde (sälherpes).
    • Om endast en brunn av ett prov i duplikat blir positiv ska behörig utsvarare bedöma om provet ska svaras eller analyseras om. Om det finns tillräcklig mängd provmaterial kvar av ursprunget utföres en ny extraktion med efterföljande PCR-analys. Vid otillräcklig provvolym repeteras enbart PCR-analysen utan ny extraktion.
      • Om prov blir negativt i duplikat vid upprepad undersökning bedöms provet som negativt och besvaras så, om inhibitionskontrollen är OK.
      • Om prov blir positivt i duplikat vid upprepad undersökning bedöms provet som positivt och det erhållna genomantalet från denna analys besvaras, om inhibitionskontrollen är OK.
      • Om endast en brunn av ett prov i duplikat blir positiv vid upprepad undersökning och inhibitionskontrollen är OK, beräknas genomantalet i denna enstaka brunn. Därefter beräknas medelvärdet på genomantalen från de två analystillfällena. Medelvärdet besvaras.
    • Om negativa extraktionskontroller som extraherats parallellt med patientprov blir positiva måste patientprov som är positiva extraheras om. Negativa patientprov kan besvaras.
    • Om NTC för ett virus blir positiv måste positiva patientprov för detta virus analyseras om. Negativa patientprov kan besvaras.
    • Om patientprovets inhibitionskontroll blir negativ måste prov om möjligt extraheras om för att sedan analyseras på nytt.
    • Om acceptorn för ett virus blir negativ eller lägre än förväntat skall alla prov för detta virus analyseras om, ny extraktion är ej nödvändig.
    • Om acceptorn för ett virus blir högre än förväntat skall alla positiva prov för detta virus analyseras om, ny extraktion är ej nödvändig. Negativa patientprov kan besvaras.


Prestanda[redigera]

Nedre detektionsgräns för alla virus i detta dokument: 200 genom/mL. Signifikant skillnad är > 3 gånger skillnad i koncentration jämfört med likadant provmaterial taget tidigare.


Mätintervall[redigera]

Linjärt mätintervall: 1x genom/mL till 10x genom/mL.

REFERENSER[redigera]

  • HSV-1: Schloss et al. An international external quality assessment of nucleic acid amplification of herpes simplex virus. Journal of Clinical Virology 28, 2003; 175-185.
  • HSV-2: Malin Enbom et al. Detection of EBV, but not Human Herpesvirus 8, DNA in Cervical Secretions From Swedish Women by Real-Time PCR. Sexually Transmitted Diseases 2001 May; 28(5):300-6.
  • Säl: G. J. J. Van Doornum et al. Diagnosing Herpesvirus Infections by Real-Time Amplification and Rapid Cilture. Journal of Clinical Microbiology Feb. 2003, p. 576-580.
Hämtad från "http://referensmetodik.folkhalsomyndigheten.se/index.php?title=Nukleinsyrabaserad_metod_för_påvisning_av_Herpes_simplexvirus-bilaga8&oldid=13437"