Shigella-laboratoriediagnostik

Huvudartikel: Shigella

---

Laboratoriediagnostik

Säkerhetsaspekter

Det skall från början klargöras att infektionsdosen för Shigella är mycket liten. Vid allt arbete med levande Shigella-bakterier eller misstänkt Shigella är det viktigt att adekvat skyddsutrustning används. Att notera är att Sh. dysenteriae typ 1 sedan 1998 (AFS 1997:12) är placerad i skyddsklass 3(**) och att det krävs tillstånd av AV för att få arbeta med denna bakterie.

Referensmetodik

Referenssubstrat

Nedanstående substrat utgör referenssubstrat för isolering av Shigella-bakterier från humana fecesprov (recepten återfinns i Bilaga 1. Bakteriologiska referenssubstrat).

Generellt rekommenderas något av de kommersiella halvfabrikat som finns på marknaden. Angående testning av loter och fortlöpande kvalitetskontroll, se Bilaga 2. Bakteriologiska referensmaterial om substratkontroll.

XLD-agar: Shigella-bakterier växer inom ett dygn med semiopaka, släta och blanka färglösa 0,5-2 mm stora kolonier (framstår röda mot mediets grundfärg). Särskilt Shigella sonnei kan uppvisa fasvariation inom och mellan kolonier. Råa kolonier med ojämna kanter kan därvid förekomma.

Shigella species växer i allmänhet med lägre GI än Salmonella, vissa stammar växer inte alls.

DC-agar modifierad enligt Hynes: Shigella-bakterier växer inom två dygn (ca 1/3 av stammar har inte växt ut efter ett dygn) med relativt låga GI-värden, ofta mindre än 50 %. Upp till 20 % av stammar som växer på icke inhibitoriskt substrat eller på XLD uppvisar mycket dålig eller ingen växt.

MacConkey-agar: Shigella-bakterier växer inom ett dygn (GI överstigande 50 %) med konvexa, semiopaka, råa och färglösa kolonier. Inkuberas i 35 °C – 37 °C i ett dygn.

Ett bra anrikningssubstrat saknas för Shigella men Selenit-buljong kan anrika särskilt Sh. sonnei (Bilaga 1. Bakteriologiska referenssubstrat).

Isolering

Primär utodling: Provmaterial på provtagningspinnen stryks ut på XLD-agar och DC-agar och sekundärstryk görs. Plattorna inkuberas i 35 °C - 37 °C. XLD-plattan avläses efter ett dygn samt DC-plattan efter ett och två dygn.

Anrikning och sekundär utodling: Anrikning av Sh. sonnei kan förekomma när Selenit-buljong används. (Anrikningsförfarandet ingår dock inte i referensförfarandet för Shigella-diagnostiken.) Provtagningspinnen stoppas efter den primära och sekundära utstrykningen ned i buljongen och inkuberas över natt i 35 °C - 37 °C. Med plastinös görs därefter utstryk på XLD-agar. Plattorna inkuberas vid 35 °C - 37 °C över natt och avläses.

Identifiering och minimikriterier

Presumtiv diagnos: På XLD-agar växer Shigella-bakterier inom ett dygn med semiopaka, släta och blanka färglösa 0,2-2 mm stora kolonier. Särskilt Shigella sonnei kan uppvisa fasvariation, varvid råa kolonier med ojämna kanter kan förekomma.

På DC-agar enligt Hynes växer Shigella inom två dygn (ca 1/3 av stammarna har inte växt ut efter 1 dygn) med semiopaka, släta eller råa, färglösa (ibland rosa/röda opaka, Shigella dysenteriae typ 1 kan vara rödlila). Centralt upphöjda (”stekt ägg”) kolonier förekommer.

Misstänkta kolonier plockas, rensprids på MacConkey-agar och identifieras med testbatteri enligt Tabell 10 efter växt över natten i 35°C - 37°C. Testbatteriet definieras i artikeln Bilaga 1c. Biokemiska referenssubstrat för testbatteri vid identifiering av bakteriella tarmpatogener.

Testbatteriet inkuberas över natten i 35°C - 37°C. Resultatet avläses och tolkas enligt tabell 10.

Tabell 10. Biokemiska referenssubstrat och förväntade resultat efter inkubering i 35-37 °C vid identifiering av Shigella-bakterier

Bakterie	Mannit 1)	LD 2)	OD 3)	H2S 2)	ONPG	Indol 4)	Urea 2)
Shigella sonnei	+/0 gas	-	+	-	+	-	-
Shigella boydii	+/0 gas	-	-	-	+	-	-
Shigella boydii/flexneri	+/0 gas	-	-	-	-	+	-
Shigella boydii/flexneri, variant	+/0 gas	-	-	-	-	-	-
Shigella dysenteriae	-	-	-	-	+	-	-
Shigella dysenteriae, variant 1	-	-	-	-	-	+	-
Shigella dysenteriae, variant 2	-	-	-	-	-	-	-

• 1) Mannit utan gas i Durhamrör. Enstaka stammar av Sh. boydii och Sh. flexneri kan jäsa mannit under gasutveckling. Enstaka stammar av Sh. flexneri, Sh. boydii och Sh. sonnei är negativa i mannit.
• 2) Positiv reaktion i endera LD, H₂S, urea eller oxidas utesluter genus Shigella.
• 3) Enstaka isolat av Sh. boydii och Sh. flexneri kan vara OD-positiva. Enstaka isolat av Sh. sonnei kan vara OD-negativa.
• 4) Positiv reaktion i både ONPG och indol utesluter i praktiken genus Shigella. Enstaka isolat av Sh. sonnei kan vara ONPG-negativa.

Bakterier som på omstrykningen har en för Shigella typisk kolonimorfologi och som jäser enligt något av utfallen i tabell 10 misstänks vara Shigella. Jäsning av glukos är ett minimikriterium för presumtiv identifiering av Shigella. Jäsning av glukos kan normalt avläsas i LD-röret genom färgomslag till gult.

Ett isolat som avviker i mer än en reaktion (enligt fotnot 1-4 tabell 10) kan i praktiken uteslutas från genus Shigella.

Isolat som misstänks vara Shigella karakteriseras ytterligare med ett kommersiellt testsystem (t.ex. API 20E). Kvarstår därefter misstanke om Shigella, sänds isolatet till Folkhälsomyndigheten för identifiering och typning.

Slutlig diagnos: För identifiering av Shigella krävs förutom testerna i den primära identifieringen att stammen är negativ i rörlighet och VP. Vidare krävs att bakterier avdödade genom kokning i 2 timmar agglutinerar i monospecifikt antiserum. Anledningen till att agglutinationen skall göras på kokta bakterier är förekomst av ett antal korsreaktioner, med främst E. coli där olika proteinantigener är ansvariga. Dessa förstörs genom kokning.

Vid ett konsensusmöte om fecesdiagnostik i april år 2002 beslutades att alla invasiva bakterier i gråzoonen mellan Shigella och EIEC, d.v.s jäser som Shigella, har virulensplasmiden men som inte agglutinerar i specifikt antiserum efter kokning, skall betraktas som EIEC och inte som Shigella.

Det är lämpligt att Folkhälsomyndigheten t.v. handhar den slutliga identifieringen av Shigella då de samlade erfarenheterna vid Folkhälsomyndigheten, i samarbete med internationella referenslaboratorier, kan komma att påverka framtida klassificering av Shigella, och att stammarna då finns tillgängliga för typning.

Avvikelser från referensmetodiken

Referensmetodiken anger en miniminivå för diagnostiken. Avvikelser från referensmetodiken måste valideras mot denna och dokumenteras.

Alternativ diagnostik

Shigella-liknande bakterier, här definierade som både Shigella och EIEC, kan med god säkerhet och med stor känslighet identifieras genom påvisande av virulensplasmiden i ett fecesprov. Vid Folkhälsomyndigheten görs detta genom att utodla feces på en MacConkey-platta och därefter analysera utväxta kolonier med PCR.

Resistensbestämning och resistensutveckling

Även om flertalet Shigella-infektioner läker ut spontant antibiotikabehandlas många patienter med god effekt. Behandling förkortar också smittsamhetsperioden. Utveckling av multiresistens har noterats främst i Sydostasien. Shigella-bakterier skall därför resistensbestämmas. Rekommendationen följer aktuell metodik utarbetad av RAF.

Epidemiologisk typning

Folkhälsomyndigheten utför rutinmässigt en begränsad serologisk typning av Shigella. Detta är särskilt viktigt vid misstanke om utbrott och inhemsk smitta. Vid behov kompletteras denna genom typning med bl.a. DNA-baserad metodik.

Kvalitetskontroll och metodkalibrering

Utförs efter de principer som anges under kvalitetssäkring i den allmänna delen

Referensstammar

I tabell 11 listas referensstammar av Shigella

Tabell 11. Shigella referensstammar vid kontroll av substrat och övriga diagnostiska procedurer.

Bakterie	CCUG	ATCC	Karakteristika	Växt (1) på XLD	Växt (1) på DC-Hynes
Shigella flexneri	21 251	-	indolpositiv	>75	>75
Shigella flexneri	32 079	12 022	normalvariant	>75	>50
Shigella sonnei	32 351	25 931	normalvariant	<25	<25
Shigella sonnei	9567	9774	normalvariant	<25	<10

Växt på 1)

1) Avser relative growth index (uttryckt i procent), d.v.s antal CFU på testagar x100/antal CFU på kontrollagar (CLED eller MacConkey), se också avsnitt substratprövning, bilaga 1.2.

Referenssera

• Sh. dysenteriae 1-13 (Reagensia AB)
• Sh. flexneri (Reagensia AB)
• Sh. flexneri monoklonaler (Reagensia AB)
• Sh. boydii 1-18 (Reagensia AB)
• Sh. sonnei SoR (Reagensia AB)

Svarsrutiner

Svar formuleras enligt laboratoriets rutiner. Vid stark misstanke om Shigella kan ett preliminärsvar om växt av misstänkt Shigella anges, samt att isolatet sänts till Folkhälsomyndigheten för verifiering. Efter erhållet svar meddelas detta till inremitterande med angivande av species samt i förekommande fall serotyp. Resistensmönster mot antibiotika skall bifogas preliminärsvaret.