Bilaga 5. Clostridium difficile-cytotoxin;analysprocedur

Huvudartikel Clostridium difficile

Sekundärartikel till Clostridium difficile-laboratoriediagnostik

---

Clostridium difficile-cytotoxin; analysprocedur

• Dag 1
  • Cirka 0,5 mL feces blandas väl med ca 2,5 mL fosfatbuffrad NaCl (PBS).
  • Centrifugera (minst 20 min vid 1000-1100 g, eller 5-10 min vid 13000-14000 g).
  • För över supernatanten (ospätt prov) till ett tomt rör. Om provet ser grumligt ut filtreras det genom sterilfilter, 0,45 µm.
  • Späd provet 1/5 och 1/50 i PBS (t.ex. 1/5 100 µL ospätt prov till 400 µL).
  • Kontrollera att cellerna är bra (ej upprundade och ett enkelt, jämnt skikt av celler).
  • Sug av mediet från det antal brunnar (2 per prov) som skall användas i cellplattan, inklusive brunnar för negativ och positiv kontroll.
  • Tillsätt 100 µL uppehållsmedium i de tömda brunnarna.
  • Tillsätt 100 µL av respektive provspädning (Provspädningarna i brunnarna är nu 1/10 och 1/100).
  • Inkubera plattan vid 37 °C i 3-10 % CO₂ över natt.

Positiv kontroll utgörs av C. difficile-toxin, spätt enligt tillverkarens instruktioner. Det spädda toxinet behandlas som fecessupernatant (ospätt prov).

Negativ kontroll. PBS används som negativ kontroll.

• Dag 2
  • Om provet bedöms som positivt i första eller båda spädningarna, eller är svårt eller omöjligt att bedöma, t.ex. om cellerna är upplösta eller hopklumpade görs neutralisationstest.
  • Neutralisationstest. Vid neutralisationstest med specifikt C. difficile-antitoxin görs en titrering av fecessupernatanten för semikvantitering av toxinhalten.
  • Antitoxin. C. difficile-antitoxin späds och förvaras enligt tillverkarens instruktioner.
    • Späd fecessupernatanten (det ospädda provet) 1/1,25, 1/12,5, 1/125, 1/1250 och 1/12500 i PBS (t.ex. 1/1,25, 200 µL till 50 µL PBS).
    • Gör antitoxin provspädningar och PBS-provspädningar i en mikrotiterplatta:
      • Antitoxin provspädningar:
      • Till vardera 3 brunnar i mikrotiterplattan sätts 50 µL C. difficile-antitoxin.
      • Tillsätt 50 µL provspädning från spädning 1/1,25, 1/12,5 och 1/125 till de 3 brunnarna. Spädningarna är nu 1/2,5, 1/25 och 1/250.
  • PBS-provspädningar
    • Till vardera 5 brunnar i mikrotiterplattan sätts 50 µL PBS med mikropipett.
    • Tillsätt 50 µL av samtliga provspädningar till de 5 brunnarna.
    • Låt antitoxin provspädningarna och PBS-provspädningarna stå i rumstemperatur 20-30 minuter.
      • Kontrollera att cellerna är bra.
      • Sug av mediet från 8 brunnar per prov i cellplattan, samt 8 brunnar för positiv kontroll och 1 brunn för den negativ kontroll.
      • Sätt 150 µL uppehållsmedium till varje brunn.
      • Sätt 50 µL av respektive PBS/provspädning (5 st) och antitoxin/provspädning (3 st) till brunnarna. De slutliga PBS/prov-spädningarna är nu 1/10, 1/100 osv., till 1/100.000 och de slutliga antitoxin/provspädningarna 1/10, 1/100 och 1/1000.
      • Positiv kontroll titreras och neutraliseras som fecessupernatant. Negativ kontroll som vid provsättning.
      • Inkubera plattan i 3–10 % CO₂ över natt.

Avläsning

Toxintester avläses i konverterat mikroskop. Toxinpåverkade celler är upprundade med karakteristiska taggar. Om minst 50 % av cellerna i brunnen är påverkade, bedöms denna spädning som positiv. Specificiteten konfirmeras med neutralisationstest med specifikt C. difficile-antitoxin före slutlig besvaring.

Toxintest bedöms som korrekt utförd om cellerna i brunnen med den negativa kontrollen är opåverkade och minst 50 % av cellerna i den positiva kontrollens brunnar är påverkade.

Neutralisationstest bedöms som korrekt utförd om den cytopatogena effekten i den positiva kontrollen neutraliserats i antitoxinspädningarna och om cellerna i brunnen med den negativa kontrollen är opåverkade.

Preliminär avläsning av toxintest

Preliminär avläsning av toxintest görs efter inkubering över natt. Toxintest som preliminärt bedöms som negativ inkuberas ytterligare 1 dygn. Om toxintest bedöms som positiv i första eller båda spädningarna, eller är svår att bedöma görs neutralisationstest.

Slutlig avläsning av toxintest

Slutgiltig avläsning av negativ toxintest görs efter 2 dygns inkubering.

Om toxintest som preliminärt bedömts som negativ bedöms som positiv i en eller båda spädningarna eller är svår att bedöma görs en titrering och neutralisationstest av provet.

Slutlig avläsning av neutralisationstest

Positiv neutralisationstest avläses slutgiltigt efter inkubering över natt.

Neutralisationstest som är negativ efter inkubering över natt, avläses slutgiltigt efter 2 dygns inkubering, som antingen negativ eller positiv.