Clostridium difficile-laboratoriediagnostik

Hoppa till: navigering, sök

Huvudartikel: Clostridium difficile

Se ocksÄ: Bilaga 5. Clostridium difficile-cytotoxin;analysprocedur


Laboratoriediagnostik av Clostridium difficile

AllmÀnt

Diagnostik av C. difficile-medierad sjukdom omfattar i första hand pÄvisning av toxin i feces. Referensmetod för toxindetektion Àr pÄvisning av cytotoxin, toxin B, i cellkultur. Flertalet cellinjer kan anvÀndas. Vissa fibroblastlinjer, t.ex. HEL-celler, reagerar pÄ brÄkdelar av picogram av C. difficile-cytotoxin. Följande indikationer för diagnostik Àr motiverade

  • Speciell misstanke pĂ„ Clostridium difficile-medierad diarrĂ© efter, eller i samband med antibiotikabehandling eller annan behandling som kan tĂ€nkas rubba tarmfloran.
  • Kontroll av behandlingseffekt efter behandlad C. difficile-infektion.
  • Screening vid diarrĂ©utbrott pĂ„ vĂ„rdavdelningar. Odling kan vara motiverad som komplement vid negativ toxintest men fortsatt klinisk misstanke vid epidemiologisk frĂ„gestĂ€llning.


Referensmetodik

PÄvisning av Clostridium difficile cytotoxin B i cellkultur Àr referensmetod.

  • Semikvantitativ pĂ„visning av Clostridium difficile cytotoxin i feces görs med hjĂ€lp av en för toxinet kĂ€nslig cellinje, t.ex. humana embryonala lungfibroblaster (HEL). Specifikt neutraliserande C. difficile antitoxin anvĂ€nds för verifiering.
  • Analysprocedur se Bilaga 5

OmsÀttning av prov

Prov som analyserats i cellplatta dÀr inte den positiva och/eller negativa kontrollen fungerat sÀtts om.

Kvalitetskontroll

Internkontroll

C. difficile cytotoxin anvÀnds vid varje analystillfÀlle som kontroll pÄ cellerna. C. difficile antitoxin anvÀnds vid varje neutralisationstesttillfÀlle som kontroll pÄ C. difficile toxinet (positiv kontroll).


FelkÀllor

  • OtillrĂ€ckligt med provmaterial.
  • Felaktig förvaring av provet (förvaring utan kylning före transport, under transport eller i laboratoriet före analys). En 25-faldig reduktion av cytotoxintitern sker efter 5 dygn i rumstemperatur och en 3-faldig reduktion inom 5 dygn vid förvaring i kylskĂ„p. I frystemperatur Ă€r titern stabil.


Alternativ diagnostik

PĂ„visning av C. difficile toxin med Enzyme immunoassay (EIA)

Under senare Är har ett flertal kommersiella tester baserade pÄ ELISA-teknik utvecklats med vilka enbart toxin A eller bÄde toxin A och toxin B samtidigt kan detekteras. Med kÀnnedom om att toxin A-/B+ stammar förekommer kan tester som endast detekterar toxin A ej rekommenderas. Det har dÀremot diskuterats om tester som detekterar toxin A och toxin B samtidigt pÄ sikt ska kunna anses som alternativ, eller ersÀtta, celltest som referensmetod. Fördelen med EIA-tester Àr att de Àr snabba, svar kan erhÄllas inom 3 timmar efter det att prov omhÀndertagits i laboratoriet. Nackdelen Àr framför allt att kÀnsligheten Àr lÀgre jÀmfört med referensmetoden, vilket medför att en lÄg toxinhalt i ett prov ej kommer att kunna detekteras.

Sensitivitet och specificitet för EIA-tester (toxin A + B) jĂ€mfört med referensmetoden varierar mellan 64 och 93 %, respektive 93 och 99 % med positiva prediktiva vĂ€rden frĂ„n 84 till 100 % och negativa prediktiva vĂ€rden frĂ„n 80 till 99 %.

Idag anvÀnder flertalet svenska laboratorier EIA-test för pÄvisning av C. difficile-toxin.


Analysprincip

Mikrotiterbrunnar med bottnar klÀdda med antikroppar riktade mot C. difficile toxin A och toxin B. Till brunnarna sÀtts spÀtt patientprov och monoklonala, enzymmÀrkta antikroppar riktade mot toxinerna A och B. Plattan inkuberas i vÀrmeblock eller inkubator. Om toxinerna finns i provet bildas ett reaktivt komplex av toxin och enzymmÀrkta antikroppar. Efter tvÀttning tillsÀtts enzymsubstrat i form av ett fÀrgÀmne och i nÀrvaro av bundet enzym utvecklas fÀrg i proportion till mÀngd bundna enzymmÀrkta antikroppar och dÀrmed till mÀngden toxin. Stopplösning tillsÀtts och resultatet avlÀses pÄ spektrofotometer.

EIA-testerna Àr enkla att utföra, alla reagenser, mikroplattor och utförlig beskrivning inkluderas i kit-lÄdan. Av erfarenhet kan dock nÄgra viktiga steg sÀrskilt pÄpekas:

  • Provet ska - oavsett konsistens - blandas noggrant innan provsĂ€ttning.
  • Botten pĂ„ brunnarna fĂ„r ej vidröras (skador i bottenbeklĂ€dningen resulterar i felaktigt absorbansvĂ€rde).
  • Inkuberingen med enzymkonjugat bör göras pĂ„ skak (minimerar antalet grĂ€nsvĂ€rden och falskt positiva resultat och förkortar dessutom testtiden).
  • Inkuberingen med substrat ska göras i mörker.
  • Utför tvĂ€ttningen noga enligt beskrivningen (för att undvika hög bakgrundsreaktion).


Serologi

Det har visats att framför allt Àldre personer med C. difficile-recidiv saknar antikroppar mot cytotoxin i blodet. Denna iakttagelse har dock ej fÄtt praktisk anvÀndning.


Bakterieodling

Referenssubstrat

  • CCFA (cykloserin-cefoxitin-fruktos agar, se Bilaga 1. Bakteriologiska referenssubstrat), selektivt medium för primĂ€rodling.
  • Oselektivt blodhaltigt medium till anaerobodling och isolering av C. difficile.
  • Anaerob buljong för eventuell anrikning av pinnprov.

Isolering

  • PrimĂ€r utodling: Kvalitativ odling pĂ„ selektivt medium.
  • Fecesprov blandas med hjĂ€lp av en provtagningpinne och med pinnen görs ett primĂ€rstryk pĂ„ CCFA-platta. Med platinös görs ett ganska tĂ€tt sekundĂ€rstryk över halva plattan och glesa tertiĂ€r- och kvartĂ€rstryk över den resterande halvan. CCFA-plattan inkuberas efter inokulering i anaerob miljö i totalt minst 2 dygn.
  • Pinnprov utodlas pĂ„ samma sĂ€tt.

Vid eventuell anrikning inokuleras provet Àven i anaerob buljong. Buljongen inkuberas i minst 2 dygn och utodlas dÀrefter pÄ CCFA.

Anrikning Àr dock ej att betrakta som referensmetod.


Identifiering och minimikriterier

  • Presumtiv diagnos: Identifiering baseras pĂ„ karakteristisk lukt, fluorescens och mikroskopisk och makroskopisk morfologi.
  • PreliminĂ€r avlĂ€sning: C. difficile-odling avlĂ€ses under luppmikroskop (x 6 - 10). PĂ„ CCFA (och andra blodhaltiga medier) vĂ€xer C. difficile med grĂ„gröna, homogena och delvis utflytande kolonier, ca 2 mm, efter inkubering över natt och ca 4 mm efter 2 dygns inkubering. PĂ„ CCFA-platta har C. difficile viss hĂ€stdoft, men doften kommer helt till sin rĂ€tt först pĂ„ oselektivt blodhaltigt medium. Under UV-lampa fluorescerar kolonier av C. difficile grönt (chartreuse - det kan ta nĂ„gra sekunder innan fluorescensen upptrĂ€der). Även C. innocuum fluorescerar chartreuse, men koloniutseende och morfologi förhindrar förvĂ€xling.
  • Odlingen anses som korrekt utförd om C. difficile-kontrollstammen vĂ€xt.

Om odlingen inkuberats i anaerobbox görs en preliminÀr avlÀsning efter inkubering över natt. Vid misstÀnkt vÀxt av C. difficile, eller om samtidig toxintest bedömts som positiv, tas plattan ut pÄ laboratoriebÀnken och eventuella typiska kolonier isoleras till oselektivt blodhaltigt anaerob medium. Isolering inkuberas anaerobt över natt.

  • Slutlig avlĂ€sning: Slutgiltig avlĂ€sning görs under luppmikroskop efter inkubering i minst 2 dygn. Om inga kolonier med typiskt utseende kan ses, bedöms odlingen som negativ.

OmsÀttning av prov

Prov omsÀtts om odlingen Àr negativ men samtidig toxin-test positiv, eller om den anaeroba miljön inte fungerat tillfredsstÀllande.

  • Minimikriterier för verifiering: Isolerad stam pĂ„ oselektivt blodhaltigt medium har typisk kolonimorfologi och utprĂ€glad hĂ€stdoft.

Under UV-lampa fluorescer kolonier i grönt (chartreuse). GramfÀrgning visar grampositiva stavar med ovala subterminala sporer.

Kontroll av toxinproduktion pÄ gjorda isolat kan vara befogat.

Kvalitetskontroll

Referensstam

  • C. difficile CCUG 4938T anvĂ€nds som internkontroll pĂ„ CCFA-plattor, som jĂ€mförelse vid luppmikroskopi, som kontroll pĂ„ den anaeroba miljön och som kontrollstam vid eventuell resistensbestĂ€mning.

FelkÀllor

  • OtillrĂ€ckligt provmaterial.
  • LĂ„ng transporttid.
  • Felaktig förvaring av provet (förvaring utan kylning före transport, under transport, eller i laboratoriet före analys).
  • Frysning av provet. Vid förvaring i fryskĂ„p sker en nĂ€rmast 100-faldig reduktion av antalet viabla C. difficile-organismer.
  • Felaktigt odlingsförfarande (t.ex. otillrĂ€ckligt anaerob miljö, för lĂ„ng tid mellan utodling och inkubering).