Genotypisk MRSA-verifiering

Artikel publicerad april 2012. Innehåll preliminärt i väntan på konsensusförfarande

---

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik:Smittskyddslagens sjukdomar

och

förgreningssidan MRSA

---

Genotypisk MRSA-verifiering exemplifierad med metod för LightCycler

Indikation

Verifiering av meticillinresistens hos S. aureus genom att påvisa mecA-gen och nuc-gen. Metoden är avsedd att användas för verifiering av misstänkta kolonier av MRSA på agarplatta som identifierats i rutin-eller screeningprover. För presumptivt påvisande av MRSA i screeningprover hänvisas till artikel MRSA-screening enligt Halmstadmodellen.

MecA-genen kodar för ett penicillinbindande protein (PBP2a) med sänkt affinitet för betalaktamantibiotika,vilket gör olika arter av mecA-bärande stafylokocker resistenta mot alla betalaktam-antibiotika inkluderande betalaktamasstabila isoxazolylpenicilliner. Särskilt allvarligt är meticillinresistens hos S. aureus, eftersom antibiotika ur denna grupp sedan länge utgjort standardterapi vid infektioner med sådana bakterier. MecA-genen sitter på en mobil kasettkromosom och är därmed benägen att sprida sig.

Metoden som beskrivs här är utformad för att påvisa förekomst av mecA-gen hos stafylokocker genom PCR-amplifiering av målområdet och detektion med SYBR Green med realtids-PCR-instrument. I kombination med påvisande av nuc-gen utförd med samma DNA-preparation är den avsedd för verifiering av fynd av MRSA. Primrar för mecA-amplifiering påvisar också en variant av mecA-genen (mecAM10/0061) som påvisats bland annat i stammen LGA251 (1, 2)

Material

Utgångsmaterialet är renstrukna kolonier på blodagar av misstänkta bakterier. För amplifiering används PCR-instrument LightCycler 2.0 (Roche Diagnostics) och reagenser LightCycler FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I (Roche Diagnostics).

• Referensstammar:
  • CCUG 35603 Staphylococcus aureus mecA+
  • CCUG 17621 Staphylococcus aureus mecA-
  • LGA251 Staphylococcus aureus mecAM10/0061

• Primrar
  • PCR primer MEC9 5´- TCACCAGGTTCAAC[Y]CAAAA (1)
  • PCR primer MEC10 5´- CCTGAATC[W]GCTAATAATATTTC (1)
  • PCR primer NUC4 5’-TCAAGTCTAAGTAGCTCAGCAAATGC (3)
  • PCR primer NUC5 5’-GAAGTTGCACTATATACTGTTGGATCT TC (3)

Analys

DNA-frisättning

Slamma en liten koloni eller motsvarande mängd bakterier i 100 µL sterilt avjoniserat vatten i ett sterilt 1.5 mL eppendorfrör. Se till att bakterien blir ordentligt uppslammad i vattnet genom att snurra platinösen och därefter resuspendera suspensionen.

Mängden bakterier är lagom för analys när man kan ana en lätt grumlighet.

PCR

Varje isolat analyseras i två separata 20 µL PCR-reaktioner, en för detektion av nuc och en för mecA. PCR-reaktionerna innehåller PCR-reagens enligt tillverkarens rekommendation, 0.5 µM av respektive primrar (NUC4/NUC5 respektive MEC9/MEC10) och 2 µL templat (suspension av bakterie).

Följande amplifieringsprofil används:

Tolkning av resultatet

Bestämning av smältpunkt (Tm) för PCR-produkter från NUC respektive mecA amplifieringsprodukter är avgörande för tolkning av resultat. Förväntade Tm för mecA PCR-produkt är runt 78.6°C, för mecA LGA251 runt 80.0°C och för NUC runt 79.2°C.

REFERENSER

• 1. Laura García-Álvarez et al. Meticillin-resistant Staphylococcus aureus with a novel mecA homologue in human and bovine populations in the UK and Denmark: a descriptive study. Lancet Infect Dis 2011;11: 595–603

• 2 Shore AC et al. Detection of staphylococcal cassette chromosome mec type XI carrying highly divergent mecA, mecI, mecR1, blaZ, and ccr genes in human clinical isolates of clonal complex 130 methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 2011 Aug;55(8):3765-73. Epub 2011 Jun 2

• 3 Peter Nilsson, Klinisk mikrobiologi, Hallands sjukhus Halmstad. Egen design.