Gonorré-laboratoriediagnostik

Hoppa till: navigering, sök

Huvudartikel: Gonorré


Bakgrund

GonorrĂ© (sĂ„vĂ€l symtomatisk som asymtomatisk) mĂ„ste för definitiv laboratoriediagnos konfirmeras genom isolering av N. gonorrhoeae (gonokocker, GC) genom odling (referensmetod), detektion av specifikt antigen eller specifik nukleinsyra i kliniska prov alternativt mikroskopisk identifiering av karakteristiska gramnegativa intracellulĂ€ra diplokocker i polymorfnukleĂ€ra leukocyter (PMNL) i utstryk av kliniska prover. Observera dock att mikroskopisk identifiering bara kan ge definitiv laboratoriediagnos för uretrautstryk frĂ„n symtomatiska mĂ€n pĂ„ grund av, för andra provtyper, suboptimal sensitivitet och Ă€ven i mĂ„nga fall suboptimal specificitet. SĂ„lunda har metoden >90 % sensitivitet för uretrautstryk frĂ„n symtomatiska mĂ€n men endast 50-75 % sensitivitet hos asymtomatiska mĂ€n och 30-50 % sensitivitet (80-95 % specificitet) för cervikala utstryk frĂ„n kvinnor. Korrekt provtyp, provtagning, fĂ€rgning och undersökning, inklusive tolkning av erfaren mikroskopist Ă€r kritiskt.

Odling Àr referensmetod pÄ grund av dess höga specificitet och sensitivitet, möjlighet att analysera alla provtyper samt utföra resistensbestÀmning och annan karakterisering. Optimerade provtagnings-, transport- och odlingsbetingelser Àr nödvÀndiga. I ett svenskt perspektiv, med relativt lÄg gonorréprevalens, Àr rutindiagnostik baserad enbart pÄ direktmikroskopi eller DNA/RNA-baserade metoder ej tillfyllest. För screening av vissa riskgrupper, anvÀndning i högprevalenta populationer eller i utvecklingslÀnder med problem avseende provtransport och/eller odling kan dock DNA/RNA-baserade metoder vara anvÀndbara.

Referensmetodik

Odling

Odling Àr referensmetod för isolering av N. gonorrhoeae frÄn alla typer av kliniska prov.

Referenssubstrat PrimÀrisolering av gonokocker frÄn kliniska prov görs pÄ tvÄ identiska substrat dÀr det ena gjorts selektivt genom antibiotikatillsats (se bilaga 1). Prover frÄn uretra, cervix och extragenitala mer sterila lokaler som konjunktiva, led, blod etc. inokuleras pÄ bÄde selektivt och icke-selektivt odlingsmedium. Prover frÄn rektum och farynx inokuleras enbart pÄ selektivt substrat.

Isolering Inokulerade plattor inkuberas snarast i CO2-termostat (5+-1 % CO2-anrikad fuktig atmosfĂ€r, 36+-1 °C) i 2 dygn, med granskning efter 1 dygn.

Identifiering och minimikriterier

Inkubering 1 dygn: Karakteristiska gonokockkolonier, vilka kan variera i fÀrg, storlek och morfologi, analyseras för produktion av oxidas. Material frÄn snabbt oxidas-positiva kolonier gramfÀrgas och renodlas idealt pÄ selektivt och icke-selektivt substrat. Inkubering av renodlingsplattor och primÀrplattan ytterligare 24 timmar.

Inkubering 2 dygn: Eventuella nyidentifierade gonokockkolonier analyseras som ovan. Utför analyser av renodlade gonokocker för definitiv specieskonfirmering (biokemisk karakterisering och antigendetektion enligt nedan) och bestÀmning av antibiotikakÀnslighet. Negativa odlingar kan svaras ut.


Presumtiv diagnos: Typiska gonokockkolonier Àr snabbt oxidas-positiva, vÀxer pÄ selektivt odlingsmedium, och bestÄr av karakteristiska gramnegativa diplokocker.

Definitiv diagnos: Presumtiv diagnos (se ovan) samt utförd specieskonfirmering Àr nödvÀndig för att kunna förse med en definitiv laboratoriediagnos. Optimalt anvÀnds Ätminstone tvÄ metoder baserade pÄ skilda principer för en hög sensitivitet och specificitet (1, 2). Problemstammar bör sÀndas till referenslaboratoriet för utförlig specieskonfirmering och vidare karakterisering.

Biokemisk karakterisering: Referenspanel för biokemisk specieskonfirmering anges i Tabell 3 och omfattar glukos (nedbrytning genererar syraproduktion), maltos, fruktos eller sackaros, och laktos (t.ex. ONPG-test). Denna diagnostik kompletteras med kommersiell metod för pÄvisande av gonokockantigen (Phadebact Monoclonal GC Test (Bactus AB)), vilken ocksÄ ger isolatets serogrupp (WI [PorB1a] eller WII/III [PorB1b]).

Kolhydratnedbrytning kan analyseras med tillvÀxtberoende (pÄ odlingsplatta; 1 dygn) eller tillvÀxtoberoende metod (i buljong; 4 h). Inokulation med rena, fÀrska kolonier frÄn renodlingsplatta (utan andra organismer eller inhiberande kontaminanter) och anvÀndning av höggradigt renat kolhydrat Àr kritiskt. Referensmedium och rekommenderade kvalitetskontroller enligt bilaga 1.

Gc-tabell3.jpg

Observera att det förekommer N. gonorrhoeae- och N. meningitidis-stammar med ej detekterbar nedbrytning av glukos. N. meningitidis stammar med ej detekterbar nedbrytning av maltos och N. cinerea stammar med detekterad glukosnedbrytning (framförallt i snabbtester) kan Àven förekomma. Kingella denitrificans, som Àr kockobacillÀr, kan förvÀxlas med gonokocker. Testning för pÄvisande av gonokockantigen bör dÀrför ocksÄ utföras.

Antigendetektion

Phadebact Monoclonal GC Test pÄvisar antigen baserat pÄ coagglutination med specifika monoklonala antikroppar riktade mot PorB hos gonokocker. Metoden har mycket hög sensitivitet och specificitet, men enstaka falskt negativa gonokockisolat samt falskt positiva isolat av N. meningitidis, N. lactamica, N. cinerea, och K. denitrificans har rapporterats internationellt, framförallt med tidigare versioner av metoden. Strikt följsamhet till tillverkarens anvisningar Àr kritiskt.

Kommersiella och alternativa specieskonfirmerande tester

Flera kommersiella tester finns tillgÀngliga för analys av kolhydratnedbrytning och annan biokemisk aktivitet för specieskonfirmering inom genus Neisseria. Exempel pÄ sÄdana Àr API-NH, RapID NH liksom identifiering med hjÀlp av kromogena substrat och andra tester som identifierar aktivitet hos specifika enzymer med diskar/tabletter (Neisseria PET). Metoderna har varierande sensitivitet och specificitet varför specieskonfirmering baserad enbart pÄ dessa inte rekommenderas (1, 2). Flera av metoderna förutsÀtter att alla gonokockstammar uttrycker enzymet prolyliminopeptidas (PIP). Senaste Ären har en global spriding av minst en PIP-negativ gonokockstam identifierats (2), med resulterande svÄrighet att specieskonfirmera med dessa tester (1, 2).

Kommersiella immunologiska tester baserade pÄ fluorescensmÀrkta antikroppar liksom DNA/RNA-baserade metoder för specieskonfirmering finns tillgÀngliga. Dessa har varierande sensitivitet och specificitet. Information om tillgÀngliga produkters prestanda och kvalitet kan lÀmnas av referenslaboratoriet.

Övriga diagnostiska metoder

Nukleinsyrabaserade metoder

MÄnga kommersiella DNA/RNA-baserade metoder för diagnostik av N. gonorrhoeae har utvecklats under de senaste decennierna. Dessa Àr baserade pÄ probe-hybridisering med specifika N. gonorrhoeae sekvenser, t.ex. Pace 2 (Gen-Probe) och Digene Hybrid Capture 2 (HC2) CT/NG (Digene Corporation), eller amplifiering av specifika nukleinsyrasekvenser, t.ex. Cobas Amplicor eller Cobas TaqMan48 (Roche Diagnostics), BD ProbeTec ET (Becton Dickinson), Aptima Combo 2 (Gen-Probe), Abbott m2000 (Abbott Laboratories) etc. Framförallt de amplifierande metoderna har hög sensitivitet och i flera fall relativt hög specificitet samt ger fördelar som möjlighet till icke-invasiv provtagning (t.ex. urin), snabbare diagnos, automatisering, ej behov av viabla bakterier, och samtidig detektion av bÄde N. gonorrhoeae och Chlamydia trachomatis. Bland nackdelarna mÀrks speciellt att de flesta av metoderna har suboptimal specificitet (sekvenslikheter med framförallt apatogena Neisseria arter i normalfloran och hög grad av interspecies genetisk överföring), effektiva och godkÀnda protokoll för extragenitala prover saknas och undersökning av antibiotikaresistens kan inte utföras (3-9). Aptima Combo 2 (Gen-Probe) och Abbott m2000 (Abbott Laboratories) utmÀrker sig dock genom att dessa system har en avsevÀrt högre specifitet. Genetiska analyser för att identifiera alla viktiga antibiotikaresistens mekanismer existerar ej.

Flera in-house diagnostiska metoder har ocksĂ„ utvecklats och tvĂ„ metoder baserade pĂ„ detektion av porA pseudogenen hos N. gonorrhoeae har ocksĂ„ hittills visat 100 % specificitet (6-8). Vid anvĂ€ndning av amplifierande tester som ej har 100 % specificitet i ett lĂ„gprevalent land som Sverige bör man konfirmera alla positiva prover med annan test, dvs. idealt odling eller Ă„tminstone genetisk test med annan mĂ„lgen. Exempelvis, vid en prevalens av 2 % (fortfarande hög) och med en sensitivitet pĂ„ 99 % och en specificitet pĂ„ 99 % blir det positiva prediktiva vĂ€rdet (PPV) endast 66,9 % (6, 9). SĂ„lunda, i Sverige med mycket lĂ€gre gonorrĂ©prevalens, blir PPV Ă€nnu lĂ€gre.

Serologi (antikroppsbestÀmning)

Komplementbindnings reaktion (KBR) med helcellsantigen av vÀrmebehandlade N. gonorrhoeae samt hemagglutination eller ELISA med piliantigen Àr utvecklade in-house metoder för att pÄvisa antikroppar mot gonokocker. Effektiva, kommersiella metoder saknas dock.

PÄvisande av antikroppar mot gonokocker i serum Àr av tveksamt diagnostiskt vÀrde vid okomplicerad gonorré pÄ grund av suboptimal sensitivitet och specificitet samt oförmÄga att skilja aktiv frÄn tidigare genomgÄngen infektion. Vid kvarstÄende misstanke om djup komplikation eller disseminerad gonokockinfektion (DGI), som ej kunnat konfirmeras genom odling, kan den dock vara av vÀrde framförallt om man kan pÄvisa signifikant titerförÀndring (~2 titersteg) vid analys av parade sera.

Antigendetektion med immunofluorescens eller enzymimmunologisk metodik (EIA/ELISA). För diagnostiskt bruk har dessa metoder ej tillrÀckligt hög prestanda.

ResistensbestÀmning

ResistensbestÀmning av gonokocker erbjuder sÀrskilda problem i val av medier, standardisering, kvalitetskontroll och tolkning av resultat. Endast laboratorier med sÀrskilt intresse för N. gonorrhoeae bör utföra grundlig resistensbestÀmning. AgarspÀdningsmetod för MIC-bestÀmning Àr fortfarande internationell referensmetod. Metoden Àr dock mindre vÀl lÀmpad som rutinmetod. Etest (Biodisk AB) kan anvÀndas som alternativ för rutinmÀssig resistensbestÀmning och har visats ha jÀmförbara prestanda med referensmetoden.

PĂ„ referenslaboratoriet utförs rutinmĂ€ssigt resistensbestĂ€mning (Etest) mot ampicillin, cefixim, ceftriaxon, azitromycin, ciprofloxacin samt spektinomycin. Vid behov analyseras Ă€ven andra antibiotika. Betalaktamas-produktion identifieras med nitrocefin disk. Ökande resistens mot de flesta tillgĂ€ngliga antibiotika Ă€r ett globalt problem och resistensen visar pĂ„ geografiska samt temporala variationer, varför det Ă€r nödvĂ€ndigt att samtliga isolat i Sverige resistensbestĂ€ms. Den aktuella resistenssituationen för N. gonorrhoeae i Sverige, beskrivning av substratrecept och metodik för resistensbestĂ€mning liksom MIC-brytpunkter för SIR-klassifikation beskrivs av referenslaboratoriet och svenska Referensgruppen för antibiotikafrĂ„gor - metodgruppen, RAF-M.

Epidemiologisk typning

N. gonorrhoeae har traditionellt karakteriserats med fenotypiska metoder som auxotypning (baserad pÄ skilda nÀringsbehov), antibiogram, samt serogruppering och serovarbestÀmning (skilda antigena epitoper hos PorB). De serologiska metoderna för epidemiologisk typning Àr snabba, praktiskt enkla och kostnadseffektiva. Metoderna har dock svagheter som subjektivitet, suboptimal diskriminerande förmÄga och tveksam reproducerbarhet. DÀrför har genetiska metoder utvecklats som kan identifiera skillnader i olika enzymer eller plasmider, enstaka eller multipla genetiska lokus (genom exempelvis sekvensering av framförallt specifika högvariabla gener), eller potentiellt indexera hela genomet hos gonokockstammar (med exempelvis pulsfÀlt gelelektrofores, PFGE). SerovarbestÀmning som primÀr epidemiologisk markör med efterföljande sekvensering av vÀl valda högvariabla gener, exempelvis med metoden N. gonorrhoeae multiantigen sequence typing (NG-MAST), ger utmÀrkt information avseende korttidsepidemiologi. NG-MAST sekvenserar variabla delar av generna för tvÄ skilda yttermembranproteiner, PorB och TbpB, och metoden har en hög diskriminerande förmÄga, objektivitet, reproducerbarhet, typningsbarhet samt generar data som kan anvÀndas för jÀmförelser mellan laboratorier (2, 4). PÄ referenslaboratoriet anvÀnds rutinmÀssigt serologisk karakterisering och vid specifika epidemiologiska frÄgestÀllningar eller i forskningssyften, mÄnga olika genetiska typningsmetoder. De specifika epidemiologiska frÄgestÀllningarna vÀgleder valet av typningsmetod(er).

Kvalitetskontroll med bilaga 1

Svarsrutiner

Isolat som det enskilda laboratoriet identifierat som N. gonorrhoeae svaras vÀxt av Neisseria gonorrhoeae, med tillÀgg att isolatet har skickats till referenslaboratoriet för definitiv diagnos och/eller vidare karakterisering och resistensbestÀmning.

Slutligt svar ges i förekommande fall efter verifiering, vidare karakterisering (serovarbestÀming) och resistensbestÀmning pÄ referenslaboratoriet. I svaret bör anges att gonorré Àr anmÀlningspliktigt enligt smittskyddslagen.

Laboratorierapportering

Gonorré Àr anmÀlningspliktig enligt smittskyddslagen (2004:168). AnmÀlan av varje fall görs till lokal smittskyddslÀkare samt till FolkhÀlsomyndigheten via SmiNet (http://www.sminet.se). Av behandlande lÀkare görs ocksÄ en klinisk anmÀlan av varje enskilt fall till smittskyddslÀkare och FolkhÀlsomyndigheten.

Referenslaboratorium

Nationella referenslaboratoriet för patogena Neisseria, Kliniskt mikrobiologiska kliniken, Universitetssjukhuset Örebro, 701 85 Örebro. Kontaktpersoner: Docent Magnus Unemo och docent Hans Fredlund.

REFERENSER

  • 1. Alexander, S., and C. Ison. Evaluation of commercial kits for the identification of Neisseria gonorrhoeae. J. Med. Microbiol. 2005; 54:827-831.
  • 2. Unemo, M., H. M. Palmer, T. Blackmore, G. Herrera, H. Fredlund, A. Limnios, N. Nguyen, and J. Tapsall. Global transmission of prolyliminopeptidase (PIP)-negative Neisseria gonorrhoeae strains – implications for changes in diagnostic strategies? Sex. Transm. Infect. 2007; 83:47-51.
  • 3. Cook, R. L., S. L. Hutchison, L. Ostergaard, R. S. Braithwaite, and R. B. Ness. Systematic review: noninvasive testing for Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae. Ann. Intern Med. 2005; 142:914-925.
  • 4. Fredlund, H., L. Falk, M. Jurstrand, and M. Unemo. Molecular genetic methods for diagnosis and characterisation of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae: impact on epidemiological surveillance and interventions. APMIS. 2004; 112:771-784.
  • 5. Palmer, H. M., H. Mallinson, R. L. Wood, and A. J. Herring. Evaluation of the specificities of five DNA amplification methods for the detection of Neisseria gonorrhoeae. J. Clin. Microbiol. 2003; 41:835-837.
  • 6. Whiley, D. M., J. W. Tapsall, and T. P. Sloots. Nucleic acid amplification testing for Neisseria gonorrhoeae: an ongoing challenge. J. Mol. Diagn. 2006; 8:3-15.
  • 7. Hjelmevoll, S. O., M. E. Olsen, J. U. Sollid, H. Haaheim, M. Unemo, and V. Skogen. A fast real-time polymerase chain reaction method for sensitive and specific detection of the Neisseria gonorrhoeae porA pseudogene. J. Mol. Diagn. 2006; 8:574-581.
  • 8. Hjelmevoll, S. O., M. E. Olsen, J. U. Ericson Sollid, H. Haaheim, K. K. Melby, H. Moi, M. Unemo, and V. Skogen. 2008. Clinical validation of a real-time polymerase chain reaction detection of Neisseria gonorrhoeae porA pseudogene versus culture technique. Sex. Transm. Dis. 2008; 35:517-520.
  • 9. Savicheva, A., E. Sokolovsky, N. Frigo, T. Priputnevich, T. Brilene, J. DeĂĄk, R. Ballard, C. Ison, A. HallĂ©n, M. Domeika, and M. Unemo. Guidelines for laboratory diagnosis of Neisseria gonorrhoeae in East-European countries. Part 2. Culture, non-culture methods, determination of antibiotic resistance, and quality assurance. Acta. Medica Lituanica. 2007; 14:123-134.
  • 10. Bignell, C. J.; European branch of the International Union against Sexually Transmitted Infection and the European Office of the World Health Organization. European guideline for the management of gonorrhoea. Int. J. STD. AIDS. 2001; 12 (suppl 3):P27-29.
  • 11. Janda W. M., and C. A. Gaydos. 2007. Neisseria, p. 601-620. In Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, and Pfaller MA (eds.). Manual of clinical microbiology, 9th ed., vol. 1. ASM Press, Washington, D.C., USA.
  • 12. Sexually Transmitted Diseases. 2007. 4th edition, Holmes KK, Sparling PF, Stamm WE, Piot P, Wasserheit JN, Corey L, Cohen MS, Watts DH (eds.). McGraw-Hill Professional, New York, USA.
  • 13. Van Dyck, E., A. Z. Meheus, and P. Piot. Gonorrhoea. In: Laboratory diagnosis of sexually transmitted diseases. World Health Organization (WHO), Geneva; 1999:1-21.