PCR-pÄvisning av Mycoplasma genitalium-bilaga3

Hoppa till: navigering, sök

Huvudartikel: Mycoplasma genitalium

SekundÀrartikel till: Mycoplasma genitalium-laboratoriediagnostik



NukleinsyrapÄvisning av Mycoplasma genitalium (ej referensmetod)

Analysprincip

Metoden beskriver analysförfarandet vid nukleinsyrapÄvisning med realtids-PCR utförd i LightCycler 1.5 (samma prestanda uppnÄs i LightCycler 480) (Roche Molecular Biochemicals) och detektion med TaqMan MGB (minor grove binder) probe. MÄl-DNA Àr sekvens pÄ 78 bp inom konserverad del av adhesionsgenen MgPa.


Reagenser

  • Probe TaqMan MgPa-380 probe (FAM-ACT TTG CAA TCA GAA GGT-MGB) (Applied Biosystems)
  • Primer MgPa-355Forward (5ÂŽ-GAG AAA TAC CTT GAT GGT CAG CAA-3ÂŽ)
  • Primer MgPa-432Reverse (5ÂŽ-GTT AAT ATC ATA TAA AGC TCT ACC GTT GTT ATC-3ÂŽ)


LightCycler Fast Start DNA Master Hybridization Probes eller LightCycler TaqMan Master eller (Roche)

UNG (Uracil-DNA Glycosylase) (Roche)

LightCycler Capillaries 20 ÎŒL (Roche)

Vid extraktion i MagnaPure: DNA Isolation Kit (Roche)

Vid manuell extraktion: Chelex 100 (Bio-Rad Lab. AB), spĂ€dd till 5 % (w/v) i destillerat vatten


Analysprocedur

Intern kontroll

  • Positiv 1. Extraktionskontroll: Poolade positiva urinprover spĂ€dda 1/10 med negativa urinprover. Prepareras och analyserassom patientprover. Notera aktuell ”crossingpoint” vid LC-PCR-körning.
  • Positiv 2. Renat DNA isolerat frĂ„n Mycoplasma genitalium ATCC 33530D, konc 1 ng/ÎŒL, spĂ€dd till 10-5. Alternativt kan kontroll erhĂ„llas frĂ„n SSI eller genom Kliniskt Forskningscenter US Örebro. Det Ă€r en DNA-preparation frĂ„n M. genitalium spĂ€dd 10-5 innehĂ„llande 10^6 genom/mL. Denna spĂ€s till att motsvara cirka 5 genom/5 ÎŒL.
  • Negativ: PCR-rent vatten

Inhibitionskontroll: 4 ÎŒL av provtemplat och 1 ÎŒL av positiv kontroll sĂ€tts till separat kapillĂ€r med mastermix.


Provberedning

  • Prov utgörs av 5-10 mL förstaportions urin, för kvinnor kompletterad med prov frĂ„n cervix/vagina. Pinnprov frĂ„n cervix/vagina sĂ€tts i samma rör som urinprovet. Förvara prov i kyl men frys ej. Kan förvaras i kyl i minst 7 dygn.
  • Urinprov och cervix/vagina i urin: Skaka prov pĂ„ vortex och överför dĂ€refter 2 mL urin till ett kryorör.

Centrifugera 20 000 g i 10 minuter.

Vid extraktion i extraktionsrobot: Sug av supernatanten av men lĂ€mna ca 300 ÎŒL av urinen kvar i röret. Slamma upp pelleten i kvarvarande urin och hantera sedan enligt anvisning. Vid manuell preparering: Sug av hela supernatanten och slamma pelleten i Chelex 100-lösning enligt nedan

  • Cervix/vagina/uretra prov i 2 SP:

Vid extraktion med robot: extrahera provet efter att det skakats pĂ„ vortex utan centrifugering enligt anvisning. Vid manuell preparering: Skaka provet pĂ„ vortex och överför dĂ€refter 100 ÎŒL till 1,0 mL 0,85 % NaCl i kryorör och centrifugera som urinprov. Sug av supernatanten och resuspendera pelleten i 300 ÎŒL Chelex 100-lösning och skaka pĂ„ vortex 60 sekunder. Inkubera i vĂ€rmeblock 95-99 0C i 10 minuter. Centrifugera 5 min i 11 000 rpm.

Mgentilmastermix.jpg
  • ProvsĂ€ttning:

SĂ€tt kapillĂ€rer i kylblock och pipettera 15 ÎŒL mastermix och 5 ÎŒL extraherat prov enligt protokoll

Mgenitpcr.jpg

JĂ€mförelser Denna realtids-PCR har jĂ€mförts genom provutbyte om 55 kliniska prover mellan laboratorierna i VĂ€sterĂ„s och Falun med jĂ€mförbart resultat (22 positiva i VĂ€sterĂ„s mot 21 positiva i Falun). Metoden anvĂ€nds pĂ„ flera laboratorier i landet och Ă€r ursprungligen utvecklad pĂ„ Örebrolaboratoriet och jĂ€mförd mot konventionell PCR pĂ„ Statens Seruminstitut (SSI) i Köpenhamn.


REFERENSER

  • 1. Jensen JS, Björnelius E, Dohn B et al. Use of Taqman 5ÂŽ nuclease real-time PCR for quantitative detection of Mycoplasma genitalium DNA in males with and without urethritis who were attendees at a sexually transmitted disease clinic. J Clin Microbiol 2004;42:683-692
  • 2. Edberg A, Jurstrand M, Johansson E, et al. A comparative study of three different PCR assays for detection of Mycoplasma genitalium in urogenital specimens from men and women. J Med Microbiol 2008 Mar; 57(Pt 3):304-9.