Skillnad mellan versioner av "Shigella-laboratoriediagnostik"
| (15 mellanliggande sidversioner av 2 användare visas inte) | |||
| Rad 5: | Rad 5: | ||
== Laboratoriediagnostik == | == Laboratoriediagnostik == | ||
| − | |||
=== Säkerhetsaspekter === | === Säkerhetsaspekter === | ||
| Rad 16: | Rad 15: | ||
=== Referenssubstrat === | === Referenssubstrat === | ||
| − | Nedanstående substrat utgör referenssubstrat för isolering av Shigella-bakterier från humana fecesprov (recepten återfinns i | + | Nedanstående substrat utgör referenssubstrat för isolering av Shigella-bakterier från humana fecesprov (recepten återfinns i [[Bilaga 1. Bakteriologiska referenssubstrat]]). |
| − | Generellt rekommenderas något av de kommersiella halvfabrikat som finns på marknaden. Angående testning av loter och fortlöpande kvalitetskontroll, se [[ | + | Generellt rekommenderas något av de kommersiella halvfabrikat som finns på marknaden. Angående testning av loter och fortlöpande kvalitetskontroll, se [[Bilaga 2. Bakteriologiska referensmaterial]] om substratkontroll. |
| − | XLD-agar | + | '''XLD-agar:''' ''Shigella''-bakterier växer inom ett dygn med semiopaka, släta och blanka färglösa 0,5-2 mm stora kolonier (framstår röda mot mediets grundfärg). Särskilt ''Shigella sonnei'' kan uppvisa fasvariation inom och mellan kolonier. Råa kolonier med ojämna kanter kan därvid förekomma. |
''Shigella'' species växer i allmänhet med lägre GI än ''Salmonella'', vissa stammar växer inte alls. | ''Shigella'' species växer i allmänhet med lägre GI än ''Salmonella'', vissa stammar växer inte alls. | ||
| − | DC-agar modifierad enligt Hynes | + | '''DC-agar modifierad enligt Hynes''': ''Shigella''-bakterier växer inom två dygn (ca 1/3 av stammar har inte växt ut efter ett dygn) med relativt låga GI-värden, ofta mindre än 50 %. Upp till 20 % av stammar som växer på icke inhibitoriskt substrat eller på XLD uppvisar mycket dålig eller ingen växt. |
| − | MacConkey-agar | + | '''MacConkey-agar''': ''Shigella''-bakterier växer inom ett dygn (GI överstigande 50 %) med konvexa, semiopaka, råa och färglösa kolonier. Inkuberas i 35 °C – 37 °C i ett dygn. |
| − | |||
| − | |||
| + | Ett bra anrikningssubstrat saknas för ''Shigella'' men Selenit-buljong kan anrika särskilt ''Sh. sonnei'' ([[Bilaga 1. Bakteriologiska referenssubstrat]]). | ||
=== Isolering === | === Isolering === | ||
| Rad 35: | Rad 33: | ||
''Primär utodling'': Provmaterial på provtagningspinnen stryks ut på XLD-agar och DC-agar och sekundärstryk görs. Plattorna inkuberas i 35 °C - 37 °C. XLD-plattan avläses efter ett dygn samt DC-plattan efter ett och två dygn. | ''Primär utodling'': Provmaterial på provtagningspinnen stryks ut på XLD-agar och DC-agar och sekundärstryk görs. Plattorna inkuberas i 35 °C - 37 °C. XLD-plattan avläses efter ett dygn samt DC-plattan efter ett och två dygn. | ||
| − | ''Anrikning och sekundär utodling'': Anrikning av Sh. sonnei kan förekomma när Selenit-buljong används. (Anrikningsförfarandet ingår dock inte i referensförfarandet för Shigella-diagnostiken.) Provtagningspinnen stoppas efter den primära och sekundära utstrykningen ned i buljongen och inkuberas över natt i 35 °C - 37 °C. Med plastinös görs | + | ''Anrikning och sekundär utodling'': Anrikning av ''Sh. sonnei'' kan förekomma när Selenit-buljong används. (Anrikningsförfarandet ingår dock inte i referensförfarandet för Shigella-diagnostiken.) Provtagningspinnen stoppas efter den primära och sekundära utstrykningen ned i buljongen och inkuberas över natt i 35 °C - 37 °C. Med plastinös görs därefter utstryk på XLD-agar. Plattorna inkuberas vid 35 °C - 37 °C över natt och avläses. |
| Rad 42: | Rad 40: | ||
''Presumtiv diagnos'': På XLD-agar växer Shigella-bakterier inom ett dygn med semiopaka, släta och blanka färglösa 0,2-2 mm stora kolonier. Särskilt Shigella sonnei kan uppvisa fasvariation, varvid råa kolonier med ojämna kanter kan förekomma. | ''Presumtiv diagnos'': På XLD-agar växer Shigella-bakterier inom ett dygn med semiopaka, släta och blanka färglösa 0,2-2 mm stora kolonier. Särskilt Shigella sonnei kan uppvisa fasvariation, varvid råa kolonier med ojämna kanter kan förekomma. | ||
| − | På DC-agar enligt Hynes växer ''Shigella'' inom två dygn (ca 1/3 av stammarna har inte växt ut efter 1 dygn) med semiopaka, släta eller råa, färglösa (ibland rosa/röda opaka, Shigella dysenteriae typ 1 kan vara rödlila). Centralt upphöjda (”stekt ägg”) kolonier förekommer | + | På DC-agar enligt Hynes växer ''Shigella'' inom två dygn (ca 1/3 av stammarna har inte växt ut efter 1 dygn) med semiopaka, släta eller råa, färglösa (ibland rosa/röda opaka, ''Shigella dysenteriae'' typ 1 kan vara rödlila). Centralt upphöjda (”stekt ägg”) kolonier förekommer. |
| − | |||
| − | |||
| − | + | Misstänkta kolonier plockas, rensprids på MacConkey-agar och identifieras med testbatteri enligt Tabell 10 efter växt över natten i 35°C - 37°C. Testbatteriet definieras i artikeln [[Bilaga 1c. Biokemiska referenssubstrat för testbatteri vid identifiering av bakteriella tarmpatogener]]. | |
| + | Testbatteriet inkuberas över natten i 35°C - 37°C. Resultatet avläses och tolkas enligt tabell 10. | ||
| − | === Tabell 10. Biokemiska referenssubstrat och förväntade resultat efter inkubering i 35-37 | + | === Tabell 10. Biokemiska referenssubstrat och förväntade resultat efter inkubering i 35-37 °C vid identifiering av ''Shigella''-bakterier === |
{| | {| | ||
| Rad 57: | Rad 54: | ||
|width="100"|'''LD 2) | |width="100"|'''LD 2) | ||
|width="100"|'''OD 3) | |width="100"|'''OD 3) | ||
| − | |width="100"|''' | + | |width="100"|'''H<sub>2</sub>S 2) |
|width="100"|'''ONPG | |width="100"|'''ONPG | ||
|width="100"|'''Indol 4) | |width="100"|'''Indol 4) | ||
| Rad 76: | Rad 73: | ||
|''Shigella dysenteriae'', variant 2 || -|| - || - ||- || -||- || - | |''Shigella dysenteriae'', variant 2 || -|| - || - ||- || -||- || - | ||
|} | |} | ||
| − | + | ||
*1) Mannit utan gas i Durhamrör. Enstaka stammar av ''Sh. boydii'' och ''Sh. flexneri'' kan jäsa mannit under gasutveckling. Enstaka stammar av ''Sh. flexneri'', ''Sh. boydii'' och ''Sh. sonnei'' är negativa i mannit. | *1) Mannit utan gas i Durhamrör. Enstaka stammar av ''Sh. boydii'' och ''Sh. flexneri'' kan jäsa mannit under gasutveckling. Enstaka stammar av ''Sh. flexneri'', ''Sh. boydii'' och ''Sh. sonnei'' är negativa i mannit. | ||
| − | *2) Positiv reaktion i endera LD, | + | *2) Positiv reaktion i endera LD, H<sub>2</sub>S, urea eller oxidas utesluter genus ''Shigella''. |
*3) Enstaka isolat av ''Sh. boydii'' och ''Sh. flexneri'' kan vara OD-positiva. Enstaka isolat av ''Sh. sonnei'' kan vara OD-negativa. | *3) Enstaka isolat av ''Sh. boydii'' och ''Sh. flexneri'' kan vara OD-positiva. Enstaka isolat av ''Sh. sonnei'' kan vara OD-negativa. | ||
*4) Positiv reaktion i både ONPG och indol utesluter i praktiken genus ''Shigella''. Enstaka isolat av ''Sh. sonnei'' kan vara ONPG-negativa. | *4) Positiv reaktion i både ONPG och indol utesluter i praktiken genus ''Shigella''. Enstaka isolat av ''Sh. sonnei'' kan vara ONPG-negativa. | ||
| Rad 88: | Rad 85: | ||
Ett isolat som avviker i mer än en reaktion (enligt fotnot 1-4 tabell 10) kan i praktiken uteslutas från genus ''Shigella''. | Ett isolat som avviker i mer än en reaktion (enligt fotnot 1-4 tabell 10) kan i praktiken uteslutas från genus ''Shigella''. | ||
| − | Isolat som misstänks vara ''Shigella'' karakteriseras ytterligare med ett kommersiellt testsystem (t.ex. API 20E). Kvarstår därefter misstanke om ''Shigella'', sänds isolatet till | + | Isolat som misstänks vara ''Shigella'' karakteriseras ytterligare med ett kommersiellt testsystem (t.ex. API 20E). Kvarstår därefter misstanke om ''Shigella'', sänds isolatet till Folkhälsomyndigheten för identifiering och typning. |
| − | + | ||
| − | ''Slutlig diagnos'': För identifiering av ''Shigella'' krävs förutom testerna i den | + | ''Slutlig diagnos'': För identifiering av ''Shigella'' krävs förutom testerna i den primära identifieringen att stammen är negativ i rörlighet och VP. Vidare krävs att bakterier avdödade genom kokning i 2 timmar agglutinerar i monospecifikt antiserum. Anledningen till att agglutinationen skall göras på kokta bakterier är förekomst av ett antal korsreaktioner, med främst'' [[E. coli]]'' där olika proteinantigener är ansvariga. Dessa förstörs genom kokning. |
Vid ett konsensusmöte om fecesdiagnostik i april år 2002 beslutades att alla invasiva bakterier i gråzoonen mellan ''Shigella'' och EIEC, d.v.s jäser som ''Shigella'', har virulensplasmiden men som inte agglutinerar i specifikt antiserum efter kokning, skall betraktas som EIEC och inte som ''Shigella''. | Vid ett konsensusmöte om fecesdiagnostik i april år 2002 beslutades att alla invasiva bakterier i gråzoonen mellan ''Shigella'' och EIEC, d.v.s jäser som ''Shigella'', har virulensplasmiden men som inte agglutinerar i specifikt antiserum efter kokning, skall betraktas som EIEC och inte som ''Shigella''. | ||
| − | Det är lämpligt att | + | Det är lämpligt att Folkhälsomyndigheten t.v. handhar den slutliga identifieringen av ''Shigella'' då de samlade erfarenheterna vid Folkhälsomyndigheten, i samarbete med internationella referenslaboratorier, kan komma att påverka framtida klassificering av ''Shigella'', och att stammarna då finns tillgängliga för typning. |
=== Avvikelser från referensmetodiken === | === Avvikelser från referensmetodiken === | ||
| Rad 103: | Rad 100: | ||
== Alternativ diagnostik == | == Alternativ diagnostik == | ||
| − | Shigella-liknande bakterier, här definierade som både ''Shigella'' och EIEC, kan med god säkerhet och med stor känslighet identifieras genom påvisande av | + | ''Shigella''-liknande bakterier, här definierade som både ''Shigella'' och EIEC, kan med god säkerhet och med stor känslighet identifieras genom påvisande av virulensplasmiden i ett fecesprov. Vid Folkhälsomyndigheten görs detta genom att utodla feces på en MacConkey-platta och därefter analysera utväxta kolonier med PCR. |
| Rad 113: | Rad 110: | ||
=== Epidemiologisk typning === | === Epidemiologisk typning === | ||
| − | + | Folkhälsomyndigheten utför rutinmässigt en begränsad serologisk typning av ''Shigella''. Detta är särskilt viktigt vid misstanke om utbrott och inhemsk smitta. Vid behov kompletteras denna genom typning med bl.a. DNA-baserad metodik. | |
| − | |||
=== Kvalitetskontroll och metodkalibrering === | === Kvalitetskontroll och metodkalibrering === | ||
| − | Utförs efter de principer som anges under kvalitetssäkring i den allmänna delen | + | Utförs efter de principer som anges under kvalitetssäkring i den allmänna delen |
| − | |||
== Referensstammar == | == Referensstammar == | ||
| Rad 152: | Rad 147: | ||
*''Sh. sonnei'' SoR (Reagensia AB) | *''Sh. sonnei'' SoR (Reagensia AB) | ||
| − | + | == Svarsrutiner== | |
| − | Svar formuleras enligt laboratoriets rutiner. Vid stark misstanke om ''Shigella'' kan ett preliminärsvar om växt av misstänkt ''Shigella'' anges, samt att isolatet sänts till | + | Svar formuleras enligt laboratoriets rutiner. Vid stark misstanke om ''Shigella'' kan ett preliminärsvar om växt av misstänkt ''Shigella'' anges, samt att isolatet sänts till Folkhälsomyndigheten för verifiering. Efter erhållet svar meddelas detta till inremitterande med angivande av species samt i förekommande fall serotyp. Resistensmönster mot antibiotika skall bifogas preliminärsvaret. |
[[Kategori:Laboratoriediagnostik-Infektioner i mage och tarm]] | [[Kategori:Laboratoriediagnostik-Infektioner i mage och tarm]] | ||
Nuvarande version från 13 januari 2014 kl. 10.53
Huvudartikel: Shigella
Laboratoriediagnostik[redigera]
Säkerhetsaspekter[redigera]
Det skall från början klargöras att infektionsdosen för Shigella är mycket liten. Vid allt arbete med levande Shigella-bakterier eller misstänkt Shigella är det viktigt att adekvat skyddsutrustning används. Att notera är att Sh. dysenteriae typ 1 sedan 1998 (AFS 1997:12) är placerad i skyddsklass 3(**) och att det krävs tillstånd av AV för att få arbeta med denna bakterie.
Referensmetodik[redigera]
Referenssubstrat[redigera]
Nedanstående substrat utgör referenssubstrat för isolering av Shigella-bakterier från humana fecesprov (recepten återfinns i Bilaga 1. Bakteriologiska referenssubstrat).
Generellt rekommenderas något av de kommersiella halvfabrikat som finns på marknaden. Angående testning av loter och fortlöpande kvalitetskontroll, se Bilaga 2. Bakteriologiska referensmaterial om substratkontroll.
XLD-agar: Shigella-bakterier växer inom ett dygn med semiopaka, släta och blanka färglösa 0,5-2 mm stora kolonier (framstår röda mot mediets grundfärg). Särskilt Shigella sonnei kan uppvisa fasvariation inom och mellan kolonier. Råa kolonier med ojämna kanter kan därvid förekomma.
Shigella species växer i allmänhet med lägre GI än Salmonella, vissa stammar växer inte alls.
DC-agar modifierad enligt Hynes: Shigella-bakterier växer inom två dygn (ca 1/3 av stammar har inte växt ut efter ett dygn) med relativt låga GI-värden, ofta mindre än 50 %. Upp till 20 % av stammar som växer på icke inhibitoriskt substrat eller på XLD uppvisar mycket dålig eller ingen växt.
MacConkey-agar: Shigella-bakterier växer inom ett dygn (GI överstigande 50 %) med konvexa, semiopaka, råa och färglösa kolonier. Inkuberas i 35 °C – 37 °C i ett dygn.
Ett bra anrikningssubstrat saknas för Shigella men Selenit-buljong kan anrika särskilt Sh. sonnei (Bilaga 1. Bakteriologiska referenssubstrat).
Isolering[redigera]
Primär utodling: Provmaterial på provtagningspinnen stryks ut på XLD-agar och DC-agar och sekundärstryk görs. Plattorna inkuberas i 35 °C - 37 °C. XLD-plattan avläses efter ett dygn samt DC-plattan efter ett och två dygn.
Anrikning och sekundär utodling: Anrikning av Sh. sonnei kan förekomma när Selenit-buljong används. (Anrikningsförfarandet ingår dock inte i referensförfarandet för Shigella-diagnostiken.) Provtagningspinnen stoppas efter den primära och sekundära utstrykningen ned i buljongen och inkuberas över natt i 35 °C - 37 °C. Med plastinös görs därefter utstryk på XLD-agar. Plattorna inkuberas vid 35 °C - 37 °C över natt och avläses.
Identifiering och minimikriterier[redigera]
Presumtiv diagnos: På XLD-agar växer Shigella-bakterier inom ett dygn med semiopaka, släta och blanka färglösa 0,2-2 mm stora kolonier. Särskilt Shigella sonnei kan uppvisa fasvariation, varvid råa kolonier med ojämna kanter kan förekomma.
På DC-agar enligt Hynes växer Shigella inom två dygn (ca 1/3 av stammarna har inte växt ut efter 1 dygn) med semiopaka, släta eller råa, färglösa (ibland rosa/röda opaka, Shigella dysenteriae typ 1 kan vara rödlila). Centralt upphöjda (”stekt ägg”) kolonier förekommer.
Misstänkta kolonier plockas, rensprids på MacConkey-agar och identifieras med testbatteri enligt Tabell 10 efter växt över natten i 35°C - 37°C. Testbatteriet definieras i artikeln Bilaga 1c. Biokemiska referenssubstrat för testbatteri vid identifiering av bakteriella tarmpatogener.
Testbatteriet inkuberas över natten i 35°C - 37°C. Resultatet avläses och tolkas enligt tabell 10.
Tabell 10. Biokemiska referenssubstrat och förväntade resultat efter inkubering i 35-37 °C vid identifiering av Shigella-bakterier[redigera]
| Bakterie | Mannit 1) | LD 2) | OD 3) | H2S 2) | ONPG | Indol 4) | Urea 2) |
| Shigella sonnei | +/0 gas | - | + | - | + | - | - |
| Shigella boydii | +/0 gas | - | - | - | + | - | - |
| Shigella boydii/flexneri | +/0 gas | - | - | - | - | + | - |
| Shigella boydii/flexneri, variant | +/0 gas | - | - | - | - | - | - |
| Shigella dysenteriae | - | - | - | - | + | - | - |
| Shigella dysenteriae, variant 1 | - | - | - | - | - | + | - |
| Shigella dysenteriae, variant 2 | - | - | - | - | - | - | - |
- 1) Mannit utan gas i Durhamrör. Enstaka stammar av Sh. boydii och Sh. flexneri kan jäsa mannit under gasutveckling. Enstaka stammar av Sh. flexneri, Sh. boydii och Sh. sonnei är negativa i mannit.
- 2) Positiv reaktion i endera LD, H2S, urea eller oxidas utesluter genus Shigella.
- 3) Enstaka isolat av Sh. boydii och Sh. flexneri kan vara OD-positiva. Enstaka isolat av Sh. sonnei kan vara OD-negativa.
- 4) Positiv reaktion i både ONPG och indol utesluter i praktiken genus Shigella. Enstaka isolat av Sh. sonnei kan vara ONPG-negativa.
Bakterier som på omstrykningen har en för Shigella typisk kolonimorfologi och som jäser enligt något av utfallen i tabell 10 misstänks vara Shigella. Jäsning av glukos är ett minimikriterium för presumtiv identifiering av Shigella. Jäsning av glukos kan normalt avläsas i LD-röret genom färgomslag till gult.
Ett isolat som avviker i mer än en reaktion (enligt fotnot 1-4 tabell 10) kan i praktiken uteslutas från genus Shigella.
Isolat som misstänks vara Shigella karakteriseras ytterligare med ett kommersiellt testsystem (t.ex. API 20E). Kvarstår därefter misstanke om Shigella, sänds isolatet till Folkhälsomyndigheten för identifiering och typning.
Slutlig diagnos: För identifiering av Shigella krävs förutom testerna i den primära identifieringen att stammen är negativ i rörlighet och VP. Vidare krävs att bakterier avdödade genom kokning i 2 timmar agglutinerar i monospecifikt antiserum. Anledningen till att agglutinationen skall göras på kokta bakterier är förekomst av ett antal korsreaktioner, med främst E. coli där olika proteinantigener är ansvariga. Dessa förstörs genom kokning.
Vid ett konsensusmöte om fecesdiagnostik i april år 2002 beslutades att alla invasiva bakterier i gråzoonen mellan Shigella och EIEC, d.v.s jäser som Shigella, har virulensplasmiden men som inte agglutinerar i specifikt antiserum efter kokning, skall betraktas som EIEC och inte som Shigella.
Det är lämpligt att Folkhälsomyndigheten t.v. handhar den slutliga identifieringen av Shigella då de samlade erfarenheterna vid Folkhälsomyndigheten, i samarbete med internationella referenslaboratorier, kan komma att påverka framtida klassificering av Shigella, och att stammarna då finns tillgängliga för typning.
Avvikelser från referensmetodiken[redigera]
Referensmetodiken anger en miniminivå för diagnostiken. Avvikelser från referensmetodiken måste valideras mot denna och dokumenteras.
Alternativ diagnostik[redigera]
Shigella-liknande bakterier, här definierade som både Shigella och EIEC, kan med god säkerhet och med stor känslighet identifieras genom påvisande av virulensplasmiden i ett fecesprov. Vid Folkhälsomyndigheten görs detta genom att utodla feces på en MacConkey-platta och därefter analysera utväxta kolonier med PCR.
Resistensbestämning och resistensutveckling[redigera]
Även om flertalet Shigella-infektioner läker ut spontant antibiotikabehandlas många patienter med god effekt. Behandling förkortar också smittsamhetsperioden. Utveckling av multiresistens har noterats främst i Sydostasien. Shigella-bakterier skall därför resistensbestämmas. Rekommendationen följer aktuell metodik utarbetad av RAF.
Epidemiologisk typning[redigera]
Folkhälsomyndigheten utför rutinmässigt en begränsad serologisk typning av Shigella. Detta är särskilt viktigt vid misstanke om utbrott och inhemsk smitta. Vid behov kompletteras denna genom typning med bl.a. DNA-baserad metodik.
Kvalitetskontroll och metodkalibrering[redigera]
Utförs efter de principer som anges under kvalitetssäkring i den allmänna delen
Referensstammar[redigera]
I tabell 11 listas referensstammar av Shigella
Tabell 11. Shigella referensstammar vid kontroll av substrat och övriga diagnostiska procedurer.[redigera]
| Bakterie | CCUG | ATCC | Karakteristika | Växt (1) på XLD | Växt (1) på DC-Hynes |
| Shigella flexneri | 21 251 | - | indolpositiv | >75 | >75 |
| Shigella flexneri | 32 079 | 12 022 | normalvariant | >75 | >50 |
| Shigella sonnei | 32 351 | 25 931 | normalvariant | <25 | <25 |
| Shigella sonnei | 9567 | 9774 | normalvariant | <25 | <10 |
Växt på 1)
1) Avser relative growth index (uttryckt i procent), d.v.s antal CFU på testagar x100/antal CFU på kontrollagar (CLED eller MacConkey), se också avsnitt substratprövning, bilaga 1.2.
Referenssera[redigera]
- Sh. dysenteriae 1-13 (Reagensia AB)
- Sh. flexneri (Reagensia AB)
- Sh. flexneri monoklonaler (Reagensia AB)
- Sh. boydii 1-18 (Reagensia AB)
- Sh. sonnei SoR (Reagensia AB)
Svarsrutiner[redigera]
Svar formuleras enligt laboratoriets rutiner. Vid stark misstanke om Shigella kan ett preliminärsvar om växt av misstänkt Shigella anges, samt att isolatet sänts till Folkhälsomyndigheten för verifiering. Efter erhållet svar meddelas detta till inremitterande med angivande av species samt i förekommande fall serotyp. Resistensmönster mot antibiotika skall bifogas preliminärsvaret.