Nukleinsyrabaserad metod för påvisning av Herpes simplexvirus-bilaga8

Artikel publicerad år 2009

---

Huvudartikel:Genital herpes simplex-infektion

Sekundärartikel till:Genital herpes simplex-laboratoriediagnostik

---

Kvantitativ PCR för HSV-1 och HSV-2 vid Smittskyddsinstitutet

Indikation

Misstanke om infektion med Herpes simplex virus typ 1 eller 2 (HSV-1, HSV-2). Med kvantitativ polymerase chain reaction (PCR)-analys är det möjligt att detektera och kvantifiera antalet virusgenom i provmaterial vilket kan utnyttjas för att följa utvecklingen av genomantal vid behandling.

Analysprincip/teststrategi

Med PCR-teknik amplifieras specifika nukleinsyrafragment (DNA-fragment) i närvaro av en fluorescerande probe. Mängden ursprungligt templat i okända prov kvantifieras genom att signalen från proben jämförs med en standardkurva generad från prov med en känd mängd templat. PCR-analysen kan dock inhiberas av olika faktorer exempelvis hämoglobin och proteinkomplex som kan finnas i de kliniska provmaterialen. På grund av detta måste alla prov extraheras innan PCR-analys. Innan extraktion tillsättes sälherpes (PhHV-1) till varje patientprov (spikning), som extraktionskontroll och inhibitionskontroll för prov i PCR-analysen.

Provmaterial Misstänkt diagnos / Symtom Virus Provmaterial CNS-infektion HSV-1 HSV-2 Cerebrospinalvätska Blåsor HSV-1 HSV-2 Blåsinnehåll

• Blåsinnehåll: Förvaras i rumstemperatur, kyl eller frys.
• Cerebrospinalvätska (CSF): volym > 200 µL. Förvara i rumstemperatur, kyl eller frys.

• Provtagningsmateriel
  • Blåsinnehåll: Virocultrör eller sterilt rör med 250 µL NaCl.
  • Cerebrospinalvätska (CSF): Sterilt rör utan tillsats.

Provtransport

• Blåsinnehåll: Kan transporteras i rumstemperatur.
• Cerebrospinalvätska (CSF): Kan transporteras i rumstemperatur.

Reagenser

• Mag Attract® DNA Mini M48 kit, Qiagen art nr: 953336 (extraktion av vätskor i BioRobot M48)
• QIAamp® DNA Blood Minikit, Qiagen art nr: 51106 (manuell extraktion av vätskor)
• Positiv extraktionskontroll för säl (PhHV-1)
• TaqMan® Universal PCR MasterMix, ABI art nr: 4318157
• MgCl₂, 25 mM
• Probe för de olika PCR-systemen
• Primrar för de olika PCR-systemen
• Standard (extraherade Namalvaceller som innehåller integrerat EBV DNA)
• Positiv kontroll (acceptor) för de olika PCR-systemen
• Negativ kontroll (NTC) för de olika PCR-systemen

Prober och primrar

• Probe för de olika PCR-systemen
  • HSV-1: 5'FAM-CAGCACACGACTTGGCGTTCTGTGT-3'TAMRA
  • HSV-2: 5'FAM-CAGACAAACGAACGCCGCCG-3'TAMRA
  • Säl: 5'FAM-TTTTTATGTGTCCGCCACCATCTGGATC-3'TAMRA

• Primrar för de olika PCR-systemen. Primrarna i HSV-1-systemet är riktade mot US5-genen.
  • HSV-1 forward: 5'-GGCCTGGCTATCCGGAGA-3'
  • HSV-1 reverse: 5'-GCGCAGAGACATCGCGA-3'

• Primrarna i HSV-2 systemet är riktade mot US4-genen.
  • HSV-2 forward: 5'-AGATATCCTCTTTATCATCAGCACCA-3'
  • HSV-2 reverse: 5'-TTGTGCTGCCAAGGCGA-3'

• Primrarna i säl Hv-systemet är riktade mot gB-genen.
  • Säl forward: 5'-GGGCGAATCACAGATTGAATC-3'
  • Säl reverse: 5'-GCGGTTCCAAACGTACCAA-3'

Analysprocedur

• Sammanfattning
  • Extraktion av DNA med valt extraktionskit. Innan extraktion tillsättes en inhibitions-kontroll till varje prov (sälherpesvirioner). Om prov spädes ut/koncentreras skall hänsyn tas till det vid beräkningen av genomkoncentrationen. Vid varje extraktion ingår även en extraktionskontroll som extraheras parallellet med övriga prov.
  • Rena mixar bereds i templatfritt rum.
  • I provtillsättningsrummet blandas extraherat prov med PCR-mixarna. Prover och kontroller fördelas i en 96-hålsplatta. Alla prover analyseras i duplikat för respektive PCR system. Alla prover analyseras även för sälherpes PCR systemet i en brunn (fungerar som inhibitions- och extraktionskontroll). Standard är 4 brunnar med cirka 5 EBV genom/brunn, 2 brunnar av vardera 50, 500, 5000 samt 50000 EBV genom/brunn. NTC (reagenskontroll utan templat, negativ) för respektive PCR system, i triplikat. Acceptor (positiv kontroll, cirka 20-50 genom/brunn) för aktuella PCR system, i triplikat. Slutvolymen på 25 µL i varje brunn består av 5 µL extraherat prov/kontroll och 20 µL PCR-mix.
  • Alla brunnarna försluts. PCR-analysen sker och analyseras direkt i PCR maskinen.

• Bedömning
  • För att ett prov skall bedömas som negativt skall båda brunnarna med aktuellt prov vara negativa. Samt att inhibitionskontrollen skall vara positiv, bör vara minst 20% positiv jämfört med extraktionskontrollens värde (sälherpes).
  • För att ett prov skall bedömas som positivt skall båda brunnarna med aktuellt prov vara positiva. Samt att inhibitionskontrollen skall vara positiv, bör vara minst 20% positiv jämfört med extraktionskontrollens värde (sälherpes).
  • Om endast en brunn av ett prov i duplikat blir positiv ska behörig utsvarare bedöma om provet ska svaras eller analyseras om. Om det finns tillräcklig mängd provmaterial kvar av ursprunget utföres en ny extraktion med efterföljande PCR-analys. Vid otillräcklig provvolym repeteras enbart PCR-analysen utan ny extraktion.
    • Om prov blir negativt i duplikat vid upprepad undersökning bedöms provet som negativt och besvaras så, om inhibitionskontrollen är OK.
    • Om prov blir positivt i duplikat vid upprepad undersökning bedöms provet som positivt och det erhållna genomantalet från denna analys besvaras, om inhibitionskontrollen är OK.
    • Om endast en brunn av ett prov i duplikat blir positiv vid upprepad undersökning och inhibitionskontrollen är OK, beräknas genomantalet i denna enstaka brunn. Därefter beräknas medelvärdet på genomantalen från de två analystillfällena. Medelvärdet besvaras.
  • Om negativa extraktionskontroller som extraherats parallellt med patientprov blir positiva måste patientprov som är positiva extraheras om. Negativa patientprov kan besvaras.
  • Om NTC för ett virus blir positiv måste positiva patientprov för detta virus analyseras om. Negativa patientprov kan besvaras.
  • Om patientprovets inhibitionskontroll blir negativ måste prov om möjligt extraheras om för att sedan analyseras på nytt.
  • Om acceptorn för ett virus blir negativ eller lägre än förväntat skall alla prov för detta virus analyseras om, ny extraktion är ej nödvändig.
  • Om acceptorn för ett virus blir högre än förväntat skall alla positiva prov för detta virus analyseras om, ny extraktion är ej nödvändig. Negativa patientprov kan besvaras.

Prestanda

Nedre detektionsgräns för alla virus i detta dokument: 200 genom/mL. Signifikant skillnad är > 3 gånger skillnad i koncentration jämfört med likadant provmaterial taget tidigare.

Mätintervall

Linjärt mätintervall: 1x$10^{3}$ genom/mL till 10x$10^{6}$ genom/mL.

REFERENSER

• HSV-1: Schloss et al. An international external quality assessment of nucleic acid amplification of herpes simplex virus. Journal of Clinical Virology 28, 2003; 175-185.

• HSV-2: Malin Enbom et al. Detection of EBV, but not Human Herpesvirus 8, DNA in Cervical Secretions From Swedish Women by Real-Time PCR. Sexually Transmitted Diseases 2001 May; 28(5):300-6.

• Säl: G. J. J. Van Doornum et al. Diagnosing Herpesvirus Infections by Real-Time Amplification and Rapid Cilture. Journal of Clinical Microbiology Feb. 2003, p. 576-580.