Yersinia enterocolitica och Yersinia pseudotuberculosis-laboratoriediagnostik

Artikel uppdaterad april 2012. Innehållet preliminärt i väntan på konsensusförfarande

Huvudartikel: Yersinia enterocolitica och Yersinia pseudotuberculosis

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Tarminfektioner, 2:a upplagan 2002

Laboratoriediagnostik

Allmänt

Alla arter av Yersinia (med undantag av Y. pestis) tillhör skyddsklass 2.

Referensmetodik

Referenssubstrat

Nedanstående substrat utgör referenssubstrat vid primärisolering av Yersinia enterocolitica och Yersinia pseudotuberculosis från humana fecesprov (recepten återfinns i Bilaga 1. Bakteriologiska referenssubstrat och i Bilaga 1c. Biokemiska referenssubstrat för testbatteri vid identifiering av bakteriella tarmpatogener).

Yersinia selective agarbas enligt Schiemann (CIN-agar) [Bilaga 1.1.5]: Jämfört med icke inhibitoriskt kontrollsubstrat växer de flesta stammarna med GI >50 %. Många stammar av Y. pseudotuberculosis växer inom två dygn med samma koloniutseende som Y. enterocolitica.

På XLD- eller Hektoen-agar kan Yersinia-bakterier också växa, men växer då med kolonier av samma utseende som övriga koliforma bakterier. På DC-agar kan Y. enterocolitica växa med typiska små ”gnistrande” kolonier.

Generellt rekommenderas något av de kommersiella halvfabrikat som finns på marknaden. Angående testning av tillverkningssatser och fortlöpande kvalitetskontroll, se Bilaga 2. Bakteriologiska referensmaterial.

Isolering

Primär utodling: Provmaterial på provtagningspinne stryks ut på CIN-agar och sekundärstryk görs. Plattan inkuberas i 28 °C - 30 °C i ett och två dygn.

Anrikning: se under avsnittet avvikelser från referensmetodiken.

Identifiering och minimikriterier

Presumtiv diagnos: Typiskt koloniutseende för Y. enterocolitica är små, centralt mörkröda och i periferin färglösa kolonier, som växer ut inom ett dygn s.k. "bull’s eye". Efter två dygn kan utseendet vara mer svårtolkat. Y. pseudotuberculosis har ett likartat utseende på CIN-agar, men i de fall bakterierna växer ut sker detta ofta först efter två dygns inkubering.

Slutlig diagnos: En säker identifiering av en patogen Yersinia med potential att orsaka yersinos kräver förutom en utökad biokemisk testpanel för fastställande av biotyp (BT 1B, BT 2, BT 3, BT 4 och BT 5) även att stammen agglutinerar i antiserum samt att virulensplasmiden och kromosomal virulensgen påvisas. Referensmetod för hur detta skall göras beskrivs nedan.

Misstänkta kolonier plockas och karakteriseras med biokemiskt testbatteri samt renstryks på MacConkey-agar som inkuberas i rumstemperatur eller 28 °C - 30 °C, över natt. Resultatet av biokemisk testning avläses och tolkas enligt tabell 12.

Tabell 12. Biokemiska referenssubstrat och förväntade resultat efter inkubering i 28 °C -30 °C vid identifiering av Yersinia-bakterier (1)

Typiskt för	Mannit	LD	OD	H₂S	ONPG	Indol	Urea
Y. enterocolitica	+/0 gas	-	+/-	-	+	-	+
Y. pseudotuberculosis	+/0 gas	-	-	-	+	-	+

(1) Observera att ovanstående biokemiska utfall ej säkert identifierar humanpatogena Yersinia-stammar. Kompletterande tester måste därför utföras (se text).

Vid misstanke på Yersinia enligt utfall enligt tabell 12 kan agglutinationstest i serogrupp-specifikt (O3 och O9) antiserum med bakterier utväxta på MacConkey-agarplattor inkuberade vid 28 °C - 30 °C utföras. Observera att inget O-antigen produceras vid 37 °C . Inte heller VP-reaktionen är positiv vid 37 °C.

Oavsett resultatet av agglutinationstestet skall ytterligare identifiering ske med kommersiell analysbricka (t.ex. API 20E), vilken inkuberas enligt tillverkarens rekommendationer. Den kommersiella testbrickan skall kompletteras med test för eskulinhydrolys (om sådan saknas i brickan) t.ex. med ROSCO-tabletter för att särskilja Y. enterocolitica biotyp 1A, som är eskulinpositiv. Notera att även Y. pseudotuberculosis är positiv i eskulin. I tabell 13 sammanfattas olika utfall av referenstesterna och i tabell 14 anges ytterligare kriterier (ej minimikriterier).

Tabell 13. Utfall av referenstester för diagnostik av humanpatogena Yersinia-bakterier, samt tolkning av resultatet

Biokemiskt testbatteri indikerar	Kommersiell analysbricka	Eskulin-hydrolys	Aggl (O3/O9)	Tolkning
Y. enterocolitica	+	-	+	Y. enterocolitica O3 resp. O9
Y. enterocolitica	+	-	-	annan humanpatogen serogrupp eller ej humanpatogen Yersinia, - Reflab
Y. enterocolitica	+	+	-	Y. enterococlitica biotyp 1A
Y. enterocolitica	+ (-)	+/-	+	oklart, -Reflab
Y. pseudotuberculosis	+	+	-	Y. pseudotuberculosis *
Y. pseudotuberculosis	+	-	-	oklart, -Reflab

Slutlig identifiering: I tabell 14 anges ytterligare diagnostiska kriterier för yersinosframkallande organismer. Oklara fall och fall med ”annan serogrupp” enligt Tabell 13 vilka kan sändas till Referenslaboratorium testas där med detta batteri. Där utökas också agglutinationstestet i serogruppsspecifikt antiserum till att förutom O3 och O9 också omfatta O5, O8 och O27. Testerna kan givetvis också utföras på de enskilda laboratorierna.

Tabell 14. Identifiering av agens motsvarande smittskyddslagens yersinos

	VP, 22 C	VP, 37 C	Rhamnos	Salicin	Melibios	Sackaros	*AA 22 C**	AA 37 C	Pyz**	Oxidas
YE O3	+	-	-	-	-	+	-	+	-	-
YE O9	+	-	-	-	-	+	-	+	-	-
YE 5/27 mm	+	-	-	-	-	+	-	+	-	-
Y. pseudo	-	-	+	+/-	+	-	-	+		-

-* Autoagglutination, kan ersättas av specifik PCR -**Pyrazin amidas-test

Avvikelser från referensmetodiken

Referensmetodiken anger en relativt hög ambitionsnivå för diagnostik av patogena Yersinia. I det praktiska arbetet på ett rutinlaboratorium kan diagnosen Y. enterocolitica O3 och O9, av en tränad bakteriolog, oftast ställas med betydligt färre biokemiska tester och utan att påvisa virulensplasmiden. Viktigt är då att man har gjort en jämförande studie som visar att de förenklingar som gjorts inte negativt påverkar specificiteten av diagnostiken. Kommersiell selektiv peptonbuljong (t.ex. Yersinia selective enrichment broth acc. to Ossmer) kan användas för anrikning, men uppgift saknas över metodens effektivitet. Det är också acceptabelt att använda selektivt Yersinia agarsubstrat enligt Wauters [Bil. 1.1.6].

För primärisolering av Y. pseudotuberculosis kan MacConkey-agar utgöra ett komplement. Odling vid 22 °C och 28 °C-30 °C kan normalt ersättas med odling i rumstemperatur.

Autoagglutination kan ersättas med ett test på kongorött-magnesiumoxalat (CR-MOX) agar, som påvisar kalciumberoende eller med specifik och utvärderad molekylärgenetisk metod (t.ex. PCR) för att påvisa virulensplasmiden.

Övrig diagnostik

Numera finns alternativ diagnostik som förutom ett alternativt biotypningschema (tabell 15) i viss omfattning baseras på molekylärgenetiska metoder för artbestämning samt virulens- och subtypning av yersiniaisolat. De molekylära metoderna kan i viss utsträckning också tillämpas direkt på humana fecesprov.

Misstänkta Y. enterocolitica-isolat på CIN-agar testas för närvaro av virulensplasmiden (pYV) med PCR eller CR-MOX-agar för att fastställa potential att orsaka typisk yersinos. Negativa isolat testas enligt tabell 15 för att identifiera isolat av Y. enterocolitica biotyp 1A. Positiva isolat testas enligt samma schema för fastställande av de patogena biotyperna, BT 1B, BT 2, BT 3, BT 4 och BT 5. De kan dessutom testas med PCR för påvisande av kromosomala virulensgener. Typning med serogruppsspecifikt antiserum för O3, O5, O8, O9 och O27 utförs därefter för påvisande av de vanligaste bioserotyperna 1B/O8; 2/O9; 2/O5, 27; 3/O5, 27; 3/O3; 4/O3; 5/O3.

Misstänkt fynd av BT 1B kan dessutom konfirmeras genom sekvensering av 16S rRNA-gen eller HPI-PCR.

Diagnosen Yersina-infektion kan efter en infektion med serotyp O3 även ställas med serologi. Känsligast är en ELISA baserad på lipopolysackarid vilken används vid vissa laboratorier. Serologiska tester som använder avdödade bakterier som antigen finns också.

Epidemiologisk typning

Utöver serotypning har en rad molekylära metoder etablerats för epidemiologisk typning t.ex. MLST, PFGE och MLVA.

Kvalitetskontroll

Metodkalibrering förväntas ske efter de principer som skisseras under avsnittet kvalitetssäkring i allmän del.

Referenstammar

Tabell 16. Lista över Yersinia-stammar som utgör referensstammar vid kontroll av substrat och övriga diagnostiska procedurer

Bakterie	CCUG	ATCC	Karakteristika	Växt (1) på CIN
Y. enterocolitica O3	8 233		Normalvariant, indol-	>50
Y. enterocolitica O8	33 055	27 729	Normalvariant, indol-	>10
Y. enterocolitica O9	82 39A		Normalvariant, indol+	>50
Y. pseudotuberculosis	17 342			>25 (2)

1) Avser relative growth index (uttryckt i procent), d.v.s. antalet CFU på testagar x100/antalet CFU på kontrollagar (CLED eller MacConkey), se Bilaga 1.2 sub¬strat-prövning.
2) Efter 2 dygns inkubering.

Referensserum

Yersinia O3 och O9 (Reagensia AB)

Resistensbestämning och resistensutveckling

Inga studier talar för gynnsam effekt av antibiotikabehandling på duration av tarmsymtom. Utdragna eller komplicerade infektioner kan behandlas med doxycyklin eller fluorokinoloner, dock med osäker effekt på uppkomsten av reaktiv artrit. Septisk Yersinia-infektion behandlas med fluorokinoloner, trim/sulfa eller senare generationer av cefalosporiner.

Svarsrutiner

Svar formuleras enligt laboratoriets rutiner. Det skall observeras att isolat av Y. enterocolitica biotyp 1A generellt inte betraktas som humanpatogen, men vissa stammar kan vara sjukdomsframkallande. Denna biotyp har hittills visats sig vara eskulinpositiva och därför har testning för eskulinhydrolys medtagits i referensmetodiken. Fynd av Yersinia enterocolitica (utom biotyp 1A) och Yersinia pseudotuberculosis är anmälningspliktiga.