Direktmikroskopi och behandling av olika vÀvnadsmaterial-svamp

Hoppa till: navigering, sök

Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik:Svampinfektioner



Artikeln reviderad april 2010


Direktmikroskopi och behandling av olika vÀvnadsmaterial

Den frÀmsta fördelen med direktmikroskopi Àr den snabbhet, med vilken man kan nÄ fram till en Ätminstone preliminÀr diagnos. I synnerhet gÀller detta vid infektion hos en immundefekt patient, dÀr svampinfektionens utgÄng i stor utstrÀckning beror pÄ med vilken snabbhet tillstÄndet kan diagnostiseras och antimykotisk behandling sÀttas in.

Direktmikroskopi med Blankophor- eller Calcofluor-fluorescens rekommenderas för att pĂ„visa svamp i alla provmaterial (referensmetod). Blankophor och Calcofluor har affinitet till hexopyranosider i b-konfiguration, vilka förekommer i stor utstrĂ€ckning i svampars cellvĂ€gg som glukaner, kitin och kitosan. Även textiltrĂ„dar och bindvĂ€vsfibriller blir fluorescerande.

Urin och tunna bronkvÀtskor centrifugeras 1500x g i 10 min. Blankophor tillsÀtts (se bilaga 2). Svampelementen fluorescerar dÄ mot en huvudsakligen blek bakgrund. JÀstceller har vanligen blÄaktig fluorescens medan mögel och dermatofyter ofta Àr ljusgröna och Malassezia har gulaktig fluorescens.


Keratinhaltig vÀvnad

Prov frÄn hud, naglar och hÄr behöver sönderdelas och digereras för att man skall komma Ät att se de olika svampelementen. Först mÄste storleken pÄ vÀvnadsbitarna minskas pÄ mekanisk vÀg, vanligtvis med hjÀlp av en skalpell. NÀr det gÀller hÄr försöker man vÀlja ut ett hÄrstrÄ med roten. I övrigt, och detta gÀller allt hud- och nagelmaterial, blir urvalet mera slumpmÀssigt.

SmÄ tunna vÀvnadsfragment placeras pÄ ett objektglas och fÀrgas med Blankophor-innehÄllande KOH. Ev. fordras lÀtt vÀrmning av hud- och nagelpreparat för att lösa upp vÀvnad och synliggöra svampstrukturer. Utan uppvÀrmning tar upplösningen lÀngre tid men kristallbildning undviks och preparatet blir mer lÀttavlÀst. Ett tÀckglas placeras ovanpÄ objektglaset och fÄr stÄ 1-10 min (ev. vÀrms lÀtt över bunsenbrÀnnare), varefter provmaterialet pressas samman för att ge ett sÄ tunt skikt som möjligt. Preparatet kan sedan betraktas i ett fluorescensmikroskop. Alternativt anvÀnds en droppe av KOH/DMSO-blandning varefter materialet granskas i faskontrastmikroskop (se bilaga 2).

Tuschpreparat kan ocksÄ anvÀndas för att synliggöra misstÀnkta kryptokocker, sÀrskilt i likvor. Kryptokocker utan kapsel i nativt material uppges förekomma, men Àr sÀllsynta. Hos framodlade kryptokocker kan det förekomma att kapseln ej Àr synlig.


Tolkning

Om man undersöker hudskrap, bör riklig förekomst av korta, lÀtt böjda hyfer och smÄ jÀstceller med bred knoppning vÀcka misstanke pÄ pityriasis versicolor (se Tabell 7b). FÀrgning med laktofenolbomullsblÄtt Àr ett snabbt och enkelt alternativ. Definitiv diagnos med hjÀlp av det mikroskopiska preparatet kan erhÄllas dÀr man ser de typiska strukturerna som snabbt tar upp den blÄ fÀrgen och Àr karakteristiska för Malassezia.

En annan mikroskopiskt karakteristisk bild Àr förekomsten av Scopulariopsis brevicaulis i naglar. HÀr kan man hitta sÄvÀl hyfer som de karakteristiska konidierna.

Fynd av hyalina hyfer som fragmenteras i oftast runda artrokonidier brukar vanligen vara tecken pÄ förekomst av dermatofyter. NÀr det gÀller infektion i hÄr, vilken lÀttast iakttas nÀra roten, ger infektionens lokalisation ledning. Invasion i hÄrkÀrnan (endotrix med artrokonidier 4-8 mm i diameter) brukar oftast orsakas av Trichophyton tonsurans, T. schoenleinii, T. violaceum och T. soudanense. Infektion av hÄrets utsida (ectotrix) kan skiljas upp i sÄdan som orsakas av dermatofyter med smÄ artrokonidier, 2-5 m m i diameter, vilka huvudsakligen Àr T. mentagrophytes, Microsporum canis, M. audouinii och M. gypseum, och sÄdan med stora artrokonidier 5-8 mm i diameter som bildas av T. verrucosum.

Fynd av knoppande celler och pseudohyfer talar för jÀstinfektion. Andra mycelbildande svampar, t.ex. Scytalidium kan ta olika former i vÀvnad och vara svÄra att skilja frÄn t ex Candida-hyfer och frÄn dermatofyter i naglar, i synnerhet om svamparna har utsatts för antimykotikabehandling. Vid tinea nigra kan svampen Hortaea werneckii upptrÀda som rikligt förekommande, tÀtt packade mörkbruna hyfer, som visar upprepade förgreningar.

HÄr- och hÄrbotteninfektioner orsakas nÀstan alltid av dermatofyter. Undantag Àr vanligtvis tropiskt förekommande svart och vit piedra. Vid svart piedra bildas smÄ noduli lÀngs hÄret och nÀr dessa krossas och studeras i ljusmikroskopi ses bruna, septerade hyfer av Piedraia hortae. Hittar man de karakteristiska klubbformade sporsÀckarna, som innehÄller 2-8 spolformade askosporer med en enda spiralvriden trÄd vid vardera polen, Àr detta diagnostiskt. Odling Àr dÄ onödig. Vid vit piedra förekommer Trichosporon-arter, vilka kan finnas pÄ normal hud. Mikroskopisk undersökning av den svullna noduli lÀngs hÄret visar tÀtt packade hyalina hyfer och artrokonidier sÀrskilt pÄ utsidan av hÄret. Denna svamp Àr lÀttodlad till skillnad frÄn P. hortae.

Direktmikroskopi ger vid ytliga infektioner en hög frekvens positiva fynd. Vid jĂ€mförelse med odling var endast 5 % av de odlingspositiva proven negativa i mikroskopi. Sannolikt kan de falskt negativa proven hĂ€nföras till att svampen Ă€r tĂ€mligen sparsamt förekommande i vĂ€vnaden och att man fĂ„r relativt begrĂ€nsad mĂ€ngd provmaterial. Man fann ocksĂ„ att 31 % av proven inte hade blivit diagnostiserade om endast odling hade utförts. Majoriteten av dessa prov (24 %) var naglar. FrĂ„n 40-50 % av infekterade naglar vĂ€xte inte svampen ut vid odling i synnerhet frĂ„n distalt provmaterial. Kvarvarande 7 % av odlingsmisslyckandena var odling frĂ„n epidermis, dĂ€r antimykotisk medicinering kan ha varit en bidragande faktor. Det Ă€r en allmĂ€n erfarenhet, att prov tagna frĂ„n hĂ€nder, ansikte och fotsulor tenderar att ge falskt negativa odlingar oftare Ă€n de, som kommer frĂ„n andra lokaler.

Sputum och bronksköljvÀtska

Undersökning av prov frÄn nedre luftvÀgarna kompliceras ofta av att antalet infekterande organismer Àr litet, och att sjÀlva provet Àr segt. De flesta prov behöver dÀrför lösas upp och koncentreras. Lika delar av provmaterial och acetylcystein blandas i ett centrifugrör och förses med lock. Röret Vortex-behandlas i ca 20 sek, varefter det kan stÄ i rumstemperatur i ungefÀr 5 min för att dÀrefter centrifugeras som ovan. Om sputum inte löses upp med detta, kan ytterligare acetylcystein tillsÀttas. Efter detta centrifugeras provet vid ca 1500x g i 10 min. Supernatet avlÀgsnas och frÄn sedimentet tas prov med ögla och fÀrgas med Blankophor eller Calcofluor (se bilaga 2). Det Àr ocksÄ möjligt att fÀrga med laktofenolbomullsblÄtt, varvid hyferna fÀrgas blÄ, dock inte sÄ starkt som för Malassezia. BehÄll gÀrna ett utstryk för senare jÀmförelse med odlingsresultatet. En ögla material tas frÄn sedimentet och sprids pÄ ett objektglas, varefter detta vÀrmefixeras.

FĂ€rdigberedd acetylcysteinlösning bör förvaras i kylskĂ„p högst 48 tim. Som alternativ till acetylcystein kan ditiotreitol, 0,5 %, anvĂ€ndas. BĂ„da dessa medel Ă€r reduktionsmedel, varför onödigt tilltrĂ€de av luft bör undvikas.


Tolkning

Candida albicans bildar knoppande jÀstceller och mycel eller pseudomycel som i luftvÀgsprov endast undantagsvis har klinisk relevans. Riklig vÀxt beror ofta pÄ antibiotikabehandling och att provmaterial frÄn djupare luftvÀgar kontamineras vid passage i svalget.

Äkta hyfer med septa i avsaknad av jĂ€stceller hĂ€rrör i Sverige nĂ€stan alltid frĂ„n Aspergillus, sĂ€rskilt A. fumigatus. Beroende pĂ„ typ av infektion upptrĂ€der i viss mĂ„n Aspergillus-hyferna olika:

  • Vid invasiv eller nekrotiserande aspergillos förekommer i vĂ€vnaden ofta vĂ€lutvecklade, septerade, dikotomt förgrenade hyfer i tĂ€mligen riklig mĂ€ngd. Hyfstrukturerna Ă€r relativt regelbundna och ger ett intryck av god tillvĂ€xt.
  • Vid allergisk bronkopulmonell aspergillos, som ofta gĂ„r med astma och eosinofili samt lungröntgenförĂ€ndringar, kan man vid exacerbationer ofta hitta Aspergillus-hyfer i slempluggar frĂ„n bronkerna. Svamphyferna liknar hĂ€r i viss utstrĂ€ckning de som förekommer vid invasiv aspergillos.


De för Aspergillus karakteristiska sporhuvudena bildas endast i aerob miljö och ses dÀrför sÀllan i vÀvnad. Vid lunginfektioner kan de dock förekomma, nÀr Aspergillus vÀxer ut i luftfyllda hÄlrum som t.ex. bronker och kaverner.

Zygomycetes har karakteristiska, breda, bandliknande hyfer utan septa, som kan invadera lungan, i synnerhet vid immunsuppression, diabetes och njurinsufficiens.

Den i Sverige vanligaste luftvÀgsinfektionen med jÀstsvamp, som har sin ingÄngsport via lungan, Àr kryptokockinfektionen. I detta stadium av infektionen pÄvisas tÀmligen sÀllan knoppande kapselförsedda jÀstceller av karakteristiskt utseende i sputum. För de i Sverige sÀllan förekommande geografiskt endemiska svampinfektionerna med ingÄngsport via lungorna eller med lungengagemang som B. dermatitidis, C. posadii tidigare C. immitis, H. capsulatum, P. brasiliensis och P. marneffei hÀnvisas till Tabell 7.

CerebrospinalvÀtska

JÀstarter som orsakar meningit kan förekomma i lÄga koncentrationer i likvor, vilket gör att man bör ta ca. 5 mL likvor som centrifugeras. Sediment anvÀnds för odling och direktmikroskopi (bilaga 2 och ref. LJR Milne). Supernatet som erhÄlls efter centrifugeringen av likvor anvÀnds för pÄvisande av kryptokockantigen, vilket Àr en avsevÀrt kÀnsligare test Àn mikroskopering. (Se Referensmetodik I 9 - Infektioner i centrala nervsystemet - CNS)


Tolkning

JÀstcellens kapsel framtrÀder som en ljus halo mot tuschens mörka kolpartiklar, vilka visar intensiv Brownsk rörelse. Leukocyter kan ge liknande fenomen men utan motsvarighet till distinkt jÀstcell inuti kapseln samt luddig yttre grÀns för kapseln. Icke-kapslade kryptokocker har dock pÄvisats i preparat frÄn AIDS-patienter.

Patienter med AIDS och andra immunkomprometterade tillstÄnd kan ha höga koncentrationer kryptokocker och samtidigt obetydlig inflammatorisk reaktion.

VĂ€vnad

VÀvnad kan tas frÄn de flesta organ och behandlas pÄ ungefÀr samma sÀtt. I vÀvnad dÀr svampinfektion misstÀnks kan man göra avtryckspreparat ("imprint") genom att lÀgga ett snitt genom den misstÀnkta vÀvnaden och trycka snittytan mot ett objektglas upprepade gÄnger. Ett glas bör göras för gramfÀrgning och ett för histopatologisk fÀrgning t.ex. enl. Grocott vilken Àr bÀttre för svamp. Samma vÀvnadsstycke kan dÀrefter trimmas ner till tunna bitar i storleksordning 1/2-1 mm och placeras pÄ ett objektglas och fÀrgas med Blankophor eller Calcofluor (bilaga 2).


Tolkning

All djupare humanvÀvnad Àr normalt fri frÄn svampmaterial, vilket gör att svampfynd bör betraktas som nÄgot onormalt. Av de biopsier som tas frÄn slemhinnor, Àr de frÄn esofagus vanligast. Fynd av jÀstceller tillsammans med pseudomycel i vÀvnaden talar för Candida-infektion, vanligtvis C. albicans. Fynd av jÀstceller utan pseudomycel kan Àven vara ett tecken pÄ Candida-infektion, Àven om diagnosen dÄ Àr nÄgot mindre sÀker.

Biopsier frÄn luftvÀgarna, t.ex. sinus, öppen lungbiopsi och lungor i samband med obduktion visar vid de flesta positiva svampfynd Aspergillus-hyfer. För övriga agens se tidigare avsnitt i detta kapitel.

De svamparter, som orsakar kromoblastomykos, kan pÄvisas i hudskrap och granulomatös vÀvnad, men Àr svÄrare i subkutana förÀndringar. HÀr förekommer sparsamt med tjockvÀggiga celler, ofta delade i tvÄ eller tetrader och pÄfallande genom sin bruna fÀrg vilken syns vid ljusmikroskopi (bilaga 2). SilverfÀrgning enligt Grocott ökar vanligtvis kontrasten mot bakgrundsvÀvnaden.

Pus och andra exsudat

Provutstryk görs pÄ objektglas för ev. fÀrgning enligt Grocott. En ögla material fÀrgas med Blankophor eller Calcofluor och granskas i fluorescensmikroskop, behandlas alternativt med KOH/DMSO, varvid faskontrast- eller ljusmikroskop anvÀnds för granskning (bilaga 2).


Tolkning

DÄ fistlar med exsudat förekommer pÄ extremiteterna och mycetom kan misstÀnkas, bör Àven förekomst av granulae undersökas. Granulae bestÄr av en kompakt massa mycel och har en storlek pÄ upp till 2 mm. FÀrgen pÄ granulae kan vara vit, gul, brun, röd eller svart och bör noteras som ett diagnostiskt hjÀlpmedel. Eftersom granulae kan vara uppbyggda av sÄvÀl aktinomyceter som Àkta mycel, Àr gramfÀrgningen viktig (Tabell 6). Bakterier förekommer som fina, (1 mm eller mindre) förgrenade, grampositiva trÄdar. Odling Àr nödvÀndig för att identifiera agens (Tabell 5).

Fynd av svamp pĂ„ bomullspinne kan vara till diagnostisk hjĂ€lp, men metoden Ă€r mycket okĂ€nslig och rekommenderas ej. Inte ens vid misstĂ€nkt Candida-vaginit Ă€r kĂ€nsligheten högre Ă€n ca 50 % av den vid mikroskopi jĂ€mfört med odling.

Urin och andra kroppsvÀtskor

Efter centrifugering görs ett utstryk frÄn sedimentet för Blankophor- eller CalcofluorfÀrgning (bilaga 2).


Tolkning

Fynd av jÀstceller eller hyfer i ascites, peritonealdialysvÀtska och andra normalt sterila vÀtskor bör rapporteras direkt till kliniken. Urin dÀremot kan kontamineras vid provtagningen frÄn uretra, vagina eller preputiet, varför inte alla fynd i urin Àr representativa för en urinvÀgsinfektion med svamp. Högt antal Candida-celler ses inte sÀllan i urinodlingar frÄn patienter med KAD. Detta Àr vanligen ett tecken pÄ kolonisation av katetern eller uretra snarare Àn urinvÀgsinfektion. Förekomst av svamp i urin kan emellertid ocksÄ vara ett tecken pÄ en disseminerad infektion hos en disponerad patient.