Identifiering-Endemiska mykoser

Hoppa till: navigering, sök

Till innehÄllsförteckningen för Referensmetodik:Svampinfektioner


Identifiering och minimikriterier, svamp

Laboratoriediagnostik av endemiska mykoser

Mikroskopi. Blankophor med NaOH rekommenderas för endemiska mykoser och kan ersĂ€tta KOH om UV-ljus anvĂ€nds (Bilaga 2). KOH 20 % i DMSO anvĂ€nds som alternativ t.ex. vid misstĂ€nkt mycetom, kromoblastomykos, feohyfomykos. Det gör det lĂ€ttare att se pigmentering hos vissa mögel i synligt ljus. 4 % formalin rekommenderas vid misstĂ€nkt sporotrikos. För att studera granulae vid mycetom anvĂ€nds gramfĂ€rgning.

Odling. De rekommenderade standardmedierna Àr tillfyllest. Vid mycetom rekommenderas tillÀgg av blodplatta för att hitta aeroba aktinomyceter. Inkubation bör ske i 30 °C och 37 °C under minst 4 veckor.

Serologi. Serologi för coccidioidomykos anses kÀnslig, för histoplasmos acceptabel men med korsreaktioner till blastomykos. Paracoccidioidomykos-serologi Àr acceptabel. För övriga endemiska mykoser Àr serologin okÀnslig eller ej utvecklad.

Hantering av kulturer frÄn dimorfa svampar

Nativt material med dimorfa svampar Àr inte smittfarligt. NÀr svampen efter utodling vÀxer i sin mögelfas Àr dock faran stor att infektiösa former sprids och orsakar smitta. DÀrför mÄste hanteringen av dimorfa svampar ske pÄ klass 3 sÀkerhetslaboratorium, AFS 2005:1.

Avdödning av misstĂ€nkta dimorfa svampkulturer för att göra preparat sker pĂ„ följande sĂ€tt: Hela kulturen tĂ€cks med 10 % formalin som fĂ„r verka i 48 tim. DĂ€refter kan preparat göras pĂ„ vanligt sĂ€tt.

Mycetom

Direktmikroskopi. Eumykotiska och aktinomykotiska granulae skiljs Ät genom mikroskopi (Bilaga 2). Eumykotiska granulae har breda, septerade hyfer, 2-5 ”m i diameter, medan aktinomykotiska innehÄller tunna bakterietrÄdar, 0,5-1 ”m i diameter, som kan gÄ över i bacillÀra och kockoida former.

Odling. En V-formad biopsi frÄn kanten av ett sinus ger bra material. Individuella granulae samlas in, men kan vara kontaminerade med ovidkommande bakterier (ev. kort spritsköljning). Eumykotiska granulae kan odlas pÄ vanlig blodagar och Sabouraudagar med antibiotika och inkuberas i 30 och 37 °C. Synlig svampvÀxt bör stickas av för att undvika bakteriell kontamination.

De aeroba aktinomyceterna odlas pÄ Löwenstein-Jensen-medium vid 37 °C. Artidentifikation av dessa kan ske med syrafastfÀrgning (svagare avfÀrgning) och biokemi.

Serologi Àr möjlig att utföra med immunelektroosmofores men förutsÀtter tillgÄng till specifika antigen och sera mot olika agens, och Àr inte rutinmetod i landet.


Kromoblastomykos

Direktmikroskopi bör göras frÄn hudskrap, krustor, aspirerat debris och biopsimaterial och studeras i ljus- eller UV-mikroskop (Bilaga 2). I ljusmikroskop ses vid positivt resultat brunpigmenterade grenade hyfer 2-6 mm tjocka. I pus frÄn cystor ser man ofta 3-8 mm skadade hyfer och bruna kroppar upp till 20 mm i diameter, som kan visa tendens till knoppning. Typiska pigmenterade sklerotiska kroppar ses enstaka eller i grupper. De Àr kastanjebruna och 6-12 mm i diameter. De syns i histopatologiska snitt som sfÀriska, tjockvÀggiga, med dubbel membran. Man kan ofta se former under delning.

Odling kan ske pÄ rutinsvampsubstrat som Sabouraudagar med antibiotika (bilaga 3). Kulturerna bör inkuberas i 25-30 °C i minst 6 veckor innan de besvaras negativa. Artdiagnostik Àr viktig prognostiskt eftersom Cladosporium svarar bÀttre pÄ behandling Àn övriga arter.

Serologi har f.n. ingen plats i diagnostiken.

Feohyfomykos

Direktpreparat studeras i ljus- eller UV-mikroskop (Bilaga 2). I ljusfÀlt Àr svampelementen oftast mörkbruna men myceldelar utan fÀrg kan ses. Element mellan 3-4 mm till cystor med 25mm diameter förekommer. Odling bör ske pÄ Sabouraudagar (bilaga 3) och inkuberas minst 6 veckor. Scytalidium Àr cykloheximidkÀnslig. VÀvnadsdelar i form av hÄrda massor eller noduli bör homogeniseras före odling. En del arter vÀxer först som svart jÀst men bildar senare mycel.

Sporotrikos

Direktmikroskopi. Var bör aspireras frĂ„n djupa abscesser eller satellitlesioner. Asteroidkroppar och cigarrkroppar kan demonstreras med direktpreparat i 95 % av fallen med kutan sporotrikos. En droppe vatten lĂ€ggs pĂ„ ett objektglas med en droppe var följt av en droppe 4 % formalin och tĂ€cks med tĂ€ckglas. Blandningen skall vara lĂ€tt opak. Betraktas i 40 x 10 förstoring i faskontrast.

Odling. Sporothrix schenckii vÀxer bra pÄ rutindiagnostiska medier om provet kommer frÄn en kutan lesion. Vid misstanke pÄ extrakutan sporotrikos bör upprepade prov och medier som Sabouraud (bilaga 3) och potatisglukosagar (bilaga 3) anvÀndas. Mycelformerna vÀxer fram pÄ Sabouraud- och anrikningsmedium efter 3-5 dagar i 24-28 °C. JÀstfasen kan fÄs fram frÄn ursprungsmaterial eller mycelfas vid 35-37 °C pÄ blodagar eller BHI-agar. Kolonierna vÀxer fram pÄ 5 dagar.

Serologi. Serodiagnostiska möjligheter finns och specificiteten Àr hög vid pÄvisande av precipiterande IgG-antikroppar mot S. schenckii. Undersökning utförs pÄ Avd. för klin. mikrobiologi, Karolinska sjukhuset (bilaga 8).

Hudtest kan utföras och vara av vÀrde speciellt pÄ immunkompetenta patienter frÄn ickeendemiskt omrÄde.

Svampdiagnostik som endast fÄr utföras pÄ sÀkerhetslaboratorium

Följande svampar fÄr endast handhas pÄ sÀkerhetslaboratorium klass 3 och med tillstÄnd av Arbetarskyddsstyrelsen (AFS 1997:12).


Blastomykos

Mikroskopi, odling och histopatologi Àr de viktigaste diagnostiska möjligheterna vid blastomykos. Vid mikroskopi (bilaga 2) ses ofta den karakteristiska jÀstfasen med tjockvÀggiga 8-15 mm citronformade jÀstceller med en bredbasig knopp.

Mycelfasen av Blastomyces dermatitidis kan odlas fram pÄ Sabouraudagar (bilaga 3) vid 30 °C pÄ ca 4 veckor. Mycelfasen kan konverteras till jÀstfas pÄ rika medier som BHI-agar (bilaga 3) vid 37 °C.

JĂ€stfasen kan ses direkt i histopatologiska snitt. De inflammatoriska förĂ€ndringarna Ă€r granulomatösa. Även epiteloidcellsgranulom och ostig nekros kan förekomma.

Serologisk IEOP-testning med helcellsantigenpreparationer Àr föga specifik och korsreaktioner med bl a Histoplasma förekommer allmÀnt.

Blastomycin hudtest Àr varken sensitivt eller specifikt.

Coccidioidomykos

Direktpreparat (Bilaga 2) av sekret eller biopsier avslöjar de typiska tjockvÀggiga upp till 60 mm stora sfÀruler som innehÄller 2-5 mm stora endosporer. Samma strukturer kan ses vid histopatologisk undersökning av biopsier, bÀst med silverfÀrgning enligt Grocott.

Odling. Coccidioides immitis vÀxer som mycel pÄ de flesta agarmedier efter 7-10 dagar vid 25-37 °C. Dessa mycelformer Àr mycket virulenta och laboratorieinfektioner har beskrivits upprepade gÄnger. Hantering av misstÀnkt mycelform av Coccidioides mÄste ske i ventilerad box utan recirkulation till rumsluften i sÀkerhetslaboratorium klass 3. Allt material som anvÀnts i samband med mycelformerna mÄste autoklaveras. DÀremot Àr inte spherulae, dvs biopsier och sekret, smittfarliga. Med tanke pÄ att mycelet kan vÀxa mellan rumstemperatur och 37 °C och Àr föga substratkrÀvande bör bandage och annat patientmaterial autoklaverasoch sÄr m.m, hos patienter lÀggas om dagligen. Ingen egentlig smitta mellan mÀnniskor har beskrivits. Om man identifierar ett mycel med artrokonidier behöver en konvertering till spherulae med endosporer ske för att verifiera Coccidioides. Detta liksom exoantigentest kan göras frÄn mycel i kultur.

Hudtest kan ske med mycelantigen, coccidioidin, eller med spherulin, vilka emellertid korsreagerar delvis med H. capsulatum.

Serologi med IEOP och immundiffusion anses vĂ€rdefulla för diagnos. Immundiffusion anses specifik för coccidioidomykos och blir positiv hos 90 % nĂ„gra veckor efter infektion. Efter 5 mĂ„nader Ă€r bara 10 % positiva. Komplementbindning blir positiv först 3-4 mĂ„n efter infektion hos 90 %.

Histoplasmos

Direktpreparat görs gÀrna med Giemsa-fÀrgning frÄn ofixerat biopsimaterial. Histoplasma capsulatum visar smÄ runda till ovala jÀstceller. Blankophor med NaOH gÄr ocksÄ bra. Vid histopatologisk undersökning bör Grocott silverfÀrgning eller PAS-fÀrgning anvÀndas. Typiska jÀstceller finns inuti makrofager eller jÀtteceller.

Odling sker pÄ Sabouraud (bilaga 3) eller potatisglukosagar (bilaga 3) med antibakteriella medel. Inkubation i 30 °C i en mÄnad. Dessutom bör odling ske pÄ BHI-agar (bilaga 3) med antibakteriella medel och blodtillsats.

Hudtest kan anvÀndas pÄ individer frÄn icke-endemiska omrÄden. Positivt utfall kan tyda pÄ fÀrsk eller genomgÄngen infektion; immundefekta svarar dÄligt.

Serologi. Precipiterande antikroppar kan pÄvisas med IEOP vid fÀrsk eller genomgÄngen infektion. Stigande titrar mellan akut och konvalescentserum kan vara stöd för aktuell infektion. Korsreaktioner mellan Histoplasma och Blastomyces vid immunprecipitation Àr vanligt.


Histoplasma duboisii

Prov utgörs av pus frÄn abscesser, exsudat frÄn mukosasÄr, lymfkörtelaspirat, skrap frÄn hudlesioner, aspirat frÄn drÀnerande sinus, sputum, magsköljvÀtska samt feces vid tarmsjukdom.

Direktmikroskopi (Bilaga 2) med KOH eller Blankophor, lĂ€mpar sig för sekret. Histopatologiska snitt fĂ€rgas med PAS eller Grocott silverfĂ€rgning. Även Giemsa och metylenblĂ„ttgĂ„r bra för fĂ€rgning av utstryk. Svampcellerna Ă€r 6-15 mm i diameter, ovala med formen av en citron eller ett öga. De kan vara anordnade i kedjor om 3-4 knoppande celler. En eller flera sfĂ€riska fettdroppar finns i cellerna och kan göra illusionen av ett öga fullstĂ€ndig. Histopatologiskt ser man mĂ„ngkĂ€rniga jĂ€tteceller pĂ„ upp till 200 ÎŒm fyllda med stora H. duboisii-former.

H. duboisii kan odlas frĂ„n biopsier eller sekret pĂ„ Sabouraudagar (bilaga 3) vid 30 °C och bildar pĂ„ 5-10 dagar en vit till beige senare brun fluffig koloni. JĂ€stfasen kan fĂ„s fram vid 37 °C pĂ„ specialsubstrat. 5-10 % CO2 underlĂ€ttar transformationen. JĂ€stformen bestĂ„r av tidigare nĂ€mnda citron- eller ögonformade celler.

Hudtest har begrÀnsat diagnostiskt vÀrde.

Serologi. PÄvisning av precipiterande antikroppar Àr diagnostiskt okÀnslig och utförs ej i Sverige.

Paracoccidioidomykos

Direktpreparat (Bilaga 2) kan göras frÄn biopsier, sputum, var och krustor, varvid Paracoccidioides brasiliensis ses som jÀstceller 2-10 x 30-60 mm. CellvÀggen Àr dubbelbrytande. Cellerna kan upptrÀda i kedjor pÄ 4 eller fler. Modercellen har 1-12 smalskaftade knoppar som kan ge det typiska fartygsrattutseendet.

Odling av materialet sker pÄ media som Sabouraudagar (bilaga 3) vid 30 °C. Odling pÄ blodagar med antibiotika men utan cykloheximid bör ocksÄ ske vid 37 °C. Kolonierna kommer fram efter 15-25 dagar och tillvÀxer lÄngsamt. JÀstformer kan komma fram direkt pÄ blodagar men Àr kÀnsliga för cykloheximid. Mycelet pÄ 30 °C plattan har inga karakteristika som gör att det kan identifieras, varför konversion pÄ blodagar vid 37 °C Àr nödvÀndigt. Histopatologiskt kan man se det typiska styrrattliknande arrangemanget av knoppande jÀstceller samt Langhans jÀtteceller, granulom och nekroser.


Penicillios

Penicillios tillhör klass 2 organismer men behandlas hÀr för sammanhangets skull.

Vid direktmikroskopi ses korta böjda celler med tvÀrsepta samt runda till ovala (jÀst)celler utan knoppning. Penicillium marneffei bildar vid odling i 25 °C gröngrÄtt luftmycel med ett rött pigment som diffunderar ut i substratet. Vid 37 °C lÀderartad mörk koloni.


Cerebral feohyfomykos

Cladophialophora bantiana Àr en mörkpigmenterad neurotrop svamp som har orsakat ett mindre antal fall av cerebral feohyfomykos.

Kolonierna Àr lÄngsamvÀxande, olivgrÄ till svarta, sammetsartade. Konidioforerna liknar hyfer och Àr blekbruna. Encelliga blastokonidier förekommer i lÄnga glest grenade kedjor som Àr föga differentierade frÄn konidiofor och vegetativ hyf. Konidierna Àr 2-2,5 gÄnger 7 mm. C. bantiana vÀxer vid 42-43 °C.