Kvalitetssäkring-diagnostik mage, tarm

Till innehållsförteckningen för Referensmetodik: Tarminfektioner, 2:a upplagan 2002

---

Kvalitetssäkring vid diagnostik av infektioner i mage och tarm

Bakgrund och syfte

Den bakteriologiska odlingsdiagnostikens möjlighet att påvisa bakterier är bland annat beroende av koncentrationen målbakterier i feces, deras viabilitet och odlingsmetodens prestanda (d.v.s. transporttider, förvaring, odlingsmediernas beskaffenhet, personalens kompetens och erfarenhet etc.). Sannolikt har laboratorierna eftersträvat bästa möjliga känslighet men p.g.a. lokala omständigheter uppnått olika slutresultat.

Kvalitetssäkring av fecesdiagnostiken omfattas av det allmänna målet jämförbarhet mellan laboratorier och över tid vid det egna laboratoriet. För att uppnå detta bör använd odlingsmetodik harmonieras mot en referensmetodik kring vilken konsensus skapats. Metodiken skall sedan, även om referensmetodiken i detalj följs, fortlöpande kontrolleras och sättas i relation till prestanda som uppnås på andra laboratorier. För detta ändamål är det önskvärt att som komplement till befintliga kontrollprogram tillskapa ett nationellt accepterat kontroll/referensmaterial bestående av utvalda referensstammar och paneler. Detta bör designas för fördjupad granskning av metodikens kvalitativa komponent d.v.s förmågan att utifrån ett spårbart kontrollmaterial identifiera isolerad mikroorganism och den kvantitativa komponenten d.v.s förmågan att utifrån ett spårbart kontrollmaterial isolera viss mikroorganism i den koncentration som överenskommits som gränsvärde (kalibreringsnivå). Den utskickade panelen år 2002 har arbetsgruppen för diagnostik av infektioner i mag-tarmkanaler tänkt utgöra första ”byggstenen” i ett sådant material. Västeråslaboratoriet har åtagit sig att tillhandahålla panelen och att framöver utvidga materialet till att omfatta olika Salmonella/Shigella/Yersinia-paneler när resurserna så tillåter.

Koncentrationen av målbakterier i feces

Vid akut enterit är exempelvis koncentrationen av Salmonella species mellan $10^{5}$-$10^{1}$$^{0}$ bakterier per gram feces. I konvalescentstadiet sjunker koncentrationen till ca $10^{4}$ bakterier per gram. Klarar aktuell föreslagen referensmetodik att påvisa denna lägre bakteriekoncentration?

Studier vid Centrallasarettet i Västerås avseende teoretisk nedre känslighetsgräns ger vid handen att pinnstryk enligt referensmetoden ger möjlighet att analysera ca 2 mg feces och anrikning i Rappaportbuljong ca 30 mg feces. Om koncentrationen vid bärarskap är $10^{4}$ målbakterier/gram feces innebär det att man med referensmetoden stryker ut ca 20 av dessa på plattan. I bästa fall växer 10 av dem ut om growth index (GI) är 50 %. Samtidigt anrikas teoretiskt 250-300 bakterier i buljongen vilket är tillräckligt för att klara även svårodlade stammar som S. Senftenberg (se Bilaga 2. Bakteriologiska referensmaterial ).

Den teoretiskt lägsta känslighetsgränsen vid primärodling för Shigella species kan på samma sätt uppskattas till $10^{3}$ bakterier/gram feces vid användning av föreslagen referensmetodik. Liknande nedre detektionsnivåer beräknar man för Campylobacter species, Yersinia species och sannolikt även för EHEC.

Substratens beskaffenhet

Känsligheten är också beroende av substratens egenskaper. Vid en omfattande svensk substratgenomgång (Thore, SMI-tryck 127-1999) noterades skillnader mellan olika fabrikats förmåga att understödja växt av målbakterier. Därtill kan förekomma smärre skillnader mellan olika tillverkningsloter (batcher) av samma fabrikat, de senare sannolikt större ju mindre väldefinierat substratet är. Vidare skiljer sig substraten i förmåga att undertrycka växt av icke målbakterier vilket påverkar sensitiviteten speciellt vid låga koncentrationer av målbakterier. Det skall noteras att upp till 60 % av odlingar på DC-agar uppvisar konfluerande växt av tarmflora i primärstryket. Det är alltså av största vikt att vara noggrann vid utodlingen så att fria kolonier erhålls i sekundär och tertiärstryk. Vid det enskilda laboratoriet är sedan variationer i den fortlöpande tillverkningen oundviklig.

Identifiering

Stor vikt bör läggas vid korrekta kriterier för identifiering, inte minst med hänvisning till att ett flertal diarréassocierade infektioner regleras genom smittskyddslagen.

EQAS

• 1. Bakterier: För att beskriva aktuella prestanda för fecesodling har externa provpaneler sänts ut från SMI till de kliniskt bakteriologiska laboratorierna i landet. Målbakterier av olika typ och i flera koncentrationer blandades med en konstant mängd kontaminerande flora bestående av Citrobacter braakii, E. coli, Proteus mirabilis och Enterococcus hirae sammanlagt motsvarande ca $10^{5}$ CFU/mL i suspenderat frystorkat material. De flesta laboratorier klarade ca $10^{4}$ CFU/mL av lättodlad Salmonella vid primärodling (se Bilaga 2.3).

Vid två olika utskick från SMI med Shigella sonnei och Shigella flexneri kunde 18 av 23 resp. 20 av 29 laboratorier hitta Shigella i koncentrationen 2x10$^{3}$ bakterier per mL.

• 2. Virala agens: Externa provpaneler preparerade vid SMI avseende diagnostik av rotavirus har regelbundet sedan 1998 sänts ut genom EQUALIS till de mikrobiologiska laboratorier som erbjuder rotavirus-diagnostik. Provpanelerna har före utskick analyserats med elektronmikroskopi, in-house ELISA för antigendetektion samt gruppspecifik PCR. Provpanelerna har består av provmaterial innehållande rikligt och sparsamt med rotavirus. Samtliga prover har dock innehållit minst $10^{6}$ viruspartiklar/mL fecessuspension som är detektionsgränsen för elektronmikroskopi. Provpanelresultaten har inneburit att vissa kommersiella tester under åren bytts ut. Vid konsensusmöte för virala agens framkom önskemål om paneler för övriga virus som adenovirus, astrovirus och calicivirus som orsakar diarré för att underlätta kvalitetssäkringsarbetet vid de enskilda laboratorierna.

Analytiska kvalitetsmål

Kvalitetssäkringens syfte är att göra resultat mellan olika laboratorier jämförbara och att åstadkomma jämförbarhet över tid vid det egna laboratoriet. För att uppnå detta krävs metodharmonisering omfattande referensmetodik för inställning och kontrollmaterial för kalibrering och spårbarhet.

Medicintekniska produkter för in vitro-diagnostik skall enligt SOSFS 1999:24 ”uppnå de prestanda som tillverkaren angett, i synnerhet, när det är tillämpligt i fråga om analytisk och diagnostisk sensitivitet, noggrannhet, repeterbarhet och reproducerbarhet --- samt gränser för påvisbarhet.”

Kvalitetskontrollen bör vid diagnostik av tarmpatogener omfatta både material som bevakar ett överenskommet gränsvärde för påvisande -kalibreringsnivå- och garanterar minimikriterier för identifiering och i förekommande fall resistensbestämning.

Gränsvärde är en term som bör skiljas från detektionsgräns, som innebär det minsta värde som kan mätas med acceptabel riktighet och precision under optimala tekniska betingelser (NCCLS). Gränsvärden är beslutsvärden. Ett gränsvärde kan som i detta fall utgöra kalibreringsnivå för vad som är acceptabelt och inte acceptabelt vid påvisande av bakterienärvaro. Det kan då bestämmas av de känslighetsgränser deltagande laboratorier redovisat i explorativa EQAS-paneler eller av den koncentration som en viss andel av medverkande laboratorier klarat att påvisa. Ett gränsvärde kan också skilja mellan ”positivt” och ”negativt” utfall som vid serologiska test – cut-off.

Gängse kvalitetskontroll inskränker sig i allmänhet till specificitetsdelen d.v.s. förmågan att rätt identifiera en isolerad mikroorganism. Med denna inskränkning relaterar kvalitetskontrollen till begreppet ”kvalitativ” och med resultatet angivet som en observation. Bearbetningen sker efter nominalskalan (scale with a set of possible values for a given kind-of property that are each a word or symbol without relation to magnitude. Example Blood group).

Härvid bortser man från att koncentrationen tarmpatogener varierar i feces och ibland faller under odlingens känslighetsgräns. Kvalitetskontrollen bör därför också omfatta en kvantitativ komponent i första hand enligt ordinalskalan (scale with an ordered set of possible values for a given kind-of-property that are each a word or symbol used for ranking according to magnitude but where differences or ratios between values have no arithmetic meaning). Andra skalor med aritmetiskt samband mellan mätvärden är inte tillämpbara.

Metodkalibrering

Det är inte möjligt att ange en känslighetsgräns (detektionsgräns) som är giltig för alla typer av Salmonella species (och andra typer av tarmpatogener) och som samtidigt är biologiskt relevant i olika medicinska situationer. Däremot går det att ange ett gränsvärde relaterat till ett spårbart och definierat kontrollmaterial avsett för nationell diagnostisk harmonisering och metodkalibrering. Särskilt värde skulle ett sådant kontrollmaterial ha vid utprövning eller kvalitetskontroll av odlingsmedier.

Med utgångspunkt från teoretiska beräkningar och erfarenheter från hittills utsända paneler antog konsensusmötet att försöksvis definiera gemensamma gränsvärden för kalibrering av salmonellaodling genom ett suspenderat frystorkat kontrollmaterial. Med ökad erfarenhet av reproducerbarhet och acceptans kunde kontrollmaterialet etableras som ett referensmaterial. Laboratoriet för klinisk mikrobiologi vid Centrallasarettet i Västerås har åtagit sig att tills vidare tillhandahålla kontrollmaterial för Salmonella species. Samma nivå borde kunna användas för Salmonella species, Shigella species, Yersinia species och Campylobacter species med avsikt att framöver, när resurserna så tillåter, utvidga materialet till att omfatta flera tarmpatogener. Arbetsgruppen har för ändamålet försökt anvisa ett adekvat urval av referensstammar och referenssera för intern kontroll (Bilaga 2. Bakteriologiska referensmaterial).